聶志奎，紀(jì)曉俊，商靜生，顏佳鋮，張璦琿，黃 和

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 南京 210009)

花生四烯酸(arachidonic acid，ARA，即 5，8，11，14-二十碳四烯酸)是一種在人類健康生活中扮演著重要角色的營養(yǎng)物質(zhì)，屬于ω-6系列長鏈多不飽和脂肪酸，是人體中含量最高、分布最廣和活躍度最高的一種必需脂肪酸［1-2］。ARA是許多生理活性物質(zhì)，比如前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯等類二十烷酸衍生物的直接前體［3-4］，ARA具有多種生物活性，在促進(jìn)智力發(fā)育、提高人體視力、增強(qiáng)免疫力和抗癌等方面具有重要作用，在生物醫(yī)藥、化妝品、功能性食品和保健品等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景［5-6］。

在過去的二十多年里，利用高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)ARA油脂已經(jīng)取得很大成功。叢蕾蕾等［7］選用抗氧化劑——沒食子酸辛酯為篩選劑，經(jīng)過紫外-LiCl復(fù)合誘變，篩選出抗脂肪酸脫氫酶抑制劑的ARA高產(chǎn)菌株，ARA占總油脂含量達(dá)到41.72%。Peng等［8］采用雙階段的發(fā)酵過程取代恒溫發(fā)酵過程，提高了總油脂和ARA含量，并添加4%的正己烷作為氧載體［9］能有效地增大溶氧和氧傳質(zhì)系數(shù)，最終增加生物量、總油脂量和ARA的濃度。鄧中濤等［10］在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提出三階段發(fā)酵的方法，更加精細(xì)地調(diào)控發(fā)酵過程，從而提高ARA油脂產(chǎn)量。但在ARA油脂的工業(yè)化發(fā)酵過程中仍存在著菌體形態(tài)難以控制、發(fā)酵周期長等問題。因此，如何進(jìn)一步提高發(fā)酵法生產(chǎn)ARA油脂的細(xì)胞干質(zhì)量、油脂含量、ARA占總脂肪酸的百分比以及縮短發(fā)酵周期、提高ARA油脂生產(chǎn)強(qiáng)度成為了推動發(fā)酵法生產(chǎn)ARA油脂持續(xù)研究的關(guān)鍵。高山被孢霉產(chǎn)ARA油脂的發(fā)酵周期一般在7～12 d。發(fā)酵周期較長，致使工業(yè)生產(chǎn)效率低，成本較高。鄧開野等［11］和潘麗軍等［12］利用分批補(bǔ)料工藝來縮短菌種發(fā)酵周期，提高ARA油脂生產(chǎn)強(qiáng)度。

培養(yǎng)方式的優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化控制的關(guān)鍵步驟。近年來，補(bǔ)料培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)上越來越被關(guān)注［13-14］。補(bǔ)料培養(yǎng)技術(shù)不但可以消除高濃度葡萄糖的阻遏效應(yīng)，還可以避免微生物在代謝過程中積累的代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生的毒害作用。補(bǔ)料培養(yǎng)技術(shù)適合于不斷改變底物濃度而提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究［15］。

筆者主要從縮短ARA油脂發(fā)酵周期以提高ARA油脂的生產(chǎn)強(qiáng)度出發(fā)，通過研究不同的底物流加方式，在保證油脂產(chǎn)量不降低的情況下，對比優(yōu)化不同的補(bǔ)料流加策略，縮短高山被孢霉產(chǎn)ARA油脂的發(fā)酵周期，以獲得一種適合ARA油脂工業(yè)化生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 菌種

高山被孢霉 R807(Mortierella alpina R807)［7］，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期2012年4月23日，保藏編號為CCTCC M 2012118。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 固體培養(yǎng)基

新鮮去皮馬鈴薯200 g，煮沸后計時30 min，4層紗布過濾去渣，加葡萄糖20 g，瓊脂25 g，加水定容至1 L;pH自然，121℃下滅菌30 min。

1.2.2 種子液體培養(yǎng)基

種子液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，酵母膏6，KH2PO43，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.5;pH 自然。115℃下滅菌30 min。

1.2.3 發(fā)酵液體培養(yǎng)基

分批發(fā)酵液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80，酵母膏10，KH2PO44，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.6;流加 250 g/L葡萄糖。

補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):初始葡萄糖40或者20，酵母膏 10，KH2PO44，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.6;流加250 g/L葡萄糖。

反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵(g/L):初始葡萄糖20，酵母膏 10，KH2PO44，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.6;流加250 g/L葡萄糖。

以上培養(yǎng)基調(diào)pH為6.0，115℃下滅菌30 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面和平板培養(yǎng)

將M.alpina R807接種于PDA試管斜面或茄子瓶，25～28℃培養(yǎng)5～7 d，待固體培養(yǎng)基表面長滿菌絲體即可制備種子培養(yǎng)液。

1.3.2 種子培養(yǎng)

取已培養(yǎng)好的新鮮斜面菌種，用無菌生理鹽水洗下菌絲，接種于新鮮種子培養(yǎng)基中，在120 r/min、25～28℃下培養(yǎng)24～48 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

利用7.5 L NBS 110型機(jī)械攪拌發(fā)酵罐培養(yǎng)。將500 mL搖瓶中活化好的種子液按10%的接種量接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，裝液量為5 L，初始pH 6.0。培養(yǎng)條件:0～8 h 0 r/min;8～24 h 100 r/min;24 h至發(fā)酵結(jié)束180 r/min，25℃，5 L/min(轉(zhuǎn)速采取分階段調(diào)控，主要考慮到高山被孢霉是一種對剪切敏感的絲狀真菌，如果前期轉(zhuǎn)速高菌絲體容易受到破壞，最后導(dǎo)致發(fā)酵失敗)。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖濃度的測定

利用SBA-40C型生物傳感儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測定葡萄糖濃度。

1.4.2 干菌體的收集與測定

利用菌絲體干質(zhì)量法測定干菌體，將培養(yǎng)物抽濾，并用蒸餾水洗滌3次。抽干后，60℃烘干至恒質(zhì)量(含水量在4%以下)，稱質(zhì)量。

1.4.3 總油脂的提取

將烘干的菌體在研缽中破碎，研磨成粉末。然后準(zhǔn)確稱1 g，用濾紙包裹好之后，利用索氏提取儀(SZF-06GI型粗脂肪測定儀)加入50 mL石油醚，抽提3 h。此方法用于提取高山被孢霉菌絲體內(nèi)油脂，質(zhì)量濃度計算見式(1)。

式中:ρ為油脂質(zhì)量濃度(g/L)，m為總胞內(nèi)油脂質(zhì)量(g)，V為發(fā)酵液體積(L)。

1.4.4 ARA含量測定

混合脂肪酸甲酯的制備:取油脂0.1 g(或干菌體0.2 g)于10 mL容量瓶中，加入5%KOH-甲醇溶液(質(zhì)量體積比)1 mL，60℃水浴10 min。取出容量瓶，室溫冷卻5 min，加入甲醇2 mL，三氟化硼-乙醚溶液1.5 mL，充分振蕩混勻，60℃水浴10 min。取出容量瓶，室溫冷卻5 min，加入正己烷2 mL，充分振蕩混勻，靜置10 min。取上層清液0.1 mL于1.5 mL離心管中，加入0.9 mL正己烷，再加入少許無水Na2SO4(用于吸水)，取1.0 μL 進(jìn)樣。

氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)條件:用 Thermo finnigan trace GC2000 DSQ型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定菌油脂肪酸組成。DB-5MS型石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。進(jìn)樣室溫度250℃，載氣為He，載氣流速1 mL/min。程序升溫:初溫80℃，以40℃/min升溫至200℃，然后10℃/min升溫至300℃。傳輸線溫度250℃，電離方式EI，70 eV，掃描范圍50 ～600 aum［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARA油脂分批發(fā)酵過程的特點(diǎn)

ARA油脂分批發(fā)酵進(jìn)程如圖1所示。

圖1 ARA油脂分批發(fā)酵進(jìn)程Fig.1 Process of ARA-rich oil batch fermentation

由圖1可知:在整個分批發(fā)酵過程中，隨著葡萄糖的消耗，細(xì)胞干質(zhì)量(DCW)逐漸增加，前期葡萄糖濃度較高，因為菌體在前12 h處于適應(yīng)階段，12 h后菌體在營養(yǎng)充足的條件下迅速增長。培養(yǎng)60 h后，菌體內(nèi)的油脂開始大量積累，此時細(xì)胞干質(zhì)量還在進(jìn)一步增加。油脂濃度隨細(xì)胞干質(zhì)量增加而不斷增加，尤其在對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期，油脂大量積累，此階段是油脂積累的關(guān)鍵階段。發(fā)酵中后期，細(xì)胞干質(zhì)量隨時間變化趨勢與油脂含量隨時間變化趨勢類似。從葡萄糖消耗曲線可以發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵起始階段，葡萄糖消耗較慢，這是因為菌體細(xì)胞主要利用培養(yǎng)基中豐富的氮源進(jìn)行快速增殖。而在發(fā)酵培養(yǎng)60 h后，氮源基本耗盡，葡萄糖消耗速度加快主要用于油脂的合成，胞內(nèi)油脂濃度逐漸增加。整個發(fā)酵持續(xù)168 h，發(fā)酵周期較長，ARA生產(chǎn)強(qiáng)度僅為0.93 g/(L·d)。分批發(fā)酵前期，葡萄糖濃度高，耗糖速度慢，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)現(xiàn)菌絲體呈絲狀，未能呈球形，這與Totani等［16］研究發(fā)現(xiàn)的高糖會誘發(fā)菌絲體呈絲狀，導(dǎo)致發(fā)酵液黏度增加，傳質(zhì)和溶氧都將會受到限制的結(jié)果一致。

2.2 ARA油脂殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料發(fā)酵

2.2.1 初糖40 g/L、殘?zhí)强刂圃?0～40 g/L

在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L的補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至20 g/L左右時，流加葡萄糖溶液維持其在20～40 g/L，發(fā)酵進(jìn)程如圖2所示。

圖2 初糖40 g/L、殘?zhí)强刂圃?0～40 g/L發(fā)酵進(jìn)程Fig.2 Process of ARA-rich oil fed-batch fermentation with initial glucose concentration 40 g/L with residual glucose controlled at 20-40 g/L

由圖2可知:120 h第4次補(bǔ)糖后，細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到25.42 g/L，殘?zhí)?4 g/L，發(fā)現(xiàn)糖耗速度變慢，如果進(jìn)一步流加葡萄糖，最后糖難以耗盡，會導(dǎo)致ARA含量變低。因此，第4次流加葡萄糖后，待糖耗盡，發(fā)酵結(jié)束。細(xì)胞干質(zhì)量在24 h時達(dá)到7.12 g/L，此時菌體利用培養(yǎng)基中的豐富氮源大量增殖菌體，24 h后耗糖速度明顯加快，到48 h后，葡萄糖質(zhì)量濃度降至20 g/L開始補(bǔ)料。整個發(fā)酵期間延滯期較短，菌體從12 h后結(jié)束延滯期，12～96 h菌體快速生長，去油生物量增長較快(從3.27增至12.96 g/L)，96 h后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，去油生物量增長緩慢，細(xì)胞干質(zhì)量進(jìn)一步的增加主要是油脂的快速積累。整個發(fā)酵持續(xù)156 h，比分批發(fā)酵縮短12 h，最終細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到29.06 g/L，油脂質(zhì)量濃度14.55 g/L，ARA含量和質(zhì)量濃度分別為41.3%和6.01 g/L。與分批發(fā)酵相比，細(xì)胞干質(zhì)量、油脂濃度及ARA濃度都有所下降，但ARA含量和生產(chǎn)強(qiáng)度變化不顯著。

2.2.2 初糖20 g/L、殘?zhí)强刂圃?0～20 g/L

在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L的補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至10 g/L左右時流加葡萄糖溶液，發(fā)酵進(jìn)程如圖3所示。由圖3可知:整個發(fā)酵期間葡萄糖濃度維持在10～20 g/L，120 h時殘?zhí)菫? g/L，此時耗糖速度在0.5 g/(L·h)左右，比發(fā)酵中期要慢，細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到29.4 g/L，與前面的補(bǔ)料方式相比有顯著提高，120 h最后1次補(bǔ)糖，待糖耗完發(fā)酵結(jié)束，整個發(fā)酵持續(xù)144 h。最終細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到31.79 g/L，與分批發(fā)酵以及“2.2.1”補(bǔ)料方式相比，雖然細(xì)胞干質(zhì)量變化不顯著，但是發(fā)酵周期進(jìn)一步縮短至144 h。發(fā)酵結(jié)束時油脂質(zhì)量濃度和ARA含量分別為15.74 g/L、42.55%，油脂濃度及ARA含量與分批發(fā)酵相比變化不顯著。

圖3 初糖20 g/L、殘?zhí)强刂圃?0～20 g/L發(fā)酵進(jìn)程Fig.3 Process of ARA-rich oil fed-batch fermentation with initial glucose concentration 20 g/L with residual glucose controlled at 10-20 g/L

2.2.3 初糖20 g/L、殘?zhí)强刂圃?～10 g/L

在前兩次補(bǔ)料分批發(fā)酵研究中分別將糖質(zhì)量濃控制在20～40 g/L以及10～20 g/L，已經(jīng)取得一些效果。進(jìn)一步降低殘?zhí)菨舛?，?dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至5 g/L左右時補(bǔ)100～200 mL 250 g/L葡萄糖溶液，將發(fā)酵液中葡萄糖維持在5～10 g/L。如果糖質(zhì)量濃度低于5 g/L時油脂會被降解用于維持細(xì)胞的基本生長，發(fā)酵進(jìn)程如圖4所示。由圖4可知:整個發(fā)酵持續(xù)120 h，發(fā)酵周期由最初分批發(fā)酵的7 d降至5 d，與前兩種補(bǔ)料方式相比也明顯縮短，生產(chǎn)強(qiáng)度顯著提高。最終，細(xì)胞干質(zhì)量、油脂質(zhì)量濃度和 ARA含量分別達(dá)到29.73 g/L、15.54 g/L和42.81%。ARA生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.33 g/(L·d)，比分批發(fā)酵的結(jié)果提高近45%。菌絲的形態(tài)都是呈大小均一的小顆粒狀，菌球邊緣呈絨毛狀有利于ARA的合成［17］。

圖4 初糖20 g/L、殘?zhí)强刂圃?～10 g/L發(fā)酵進(jìn)程Fig.4 Process of ARA-rich oil fed-batch fermentation with initial glucose concentration 20 g/L with residual glucose controlled at 5-10 g/L

2.3 ARA油脂反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵

由于高山被孢霉種子培養(yǎng)非常關(guān)鍵并且耗時長，通常從斜面活化一批種子要3.5 d，一級種子活化要1.5 d，二級種子活化要1 d，一批種子培養(yǎng)需要6 d，接近發(fā)酵周期，種子形態(tài)控制不好還會直接影響發(fā)酵結(jié)果。雖然種子的培養(yǎng)和發(fā)酵過程可以獨(dú)立，不直接影響發(fā)酵周期，但是會直接增加人力物力成本，進(jìn)而提高ARA油脂的生產(chǎn)成本。在微生物培養(yǎng)過程中，采用反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，由于只需1次菌種活化及種子培養(yǎng)，就可以進(jìn)行多個批次的發(fā)酵，將顯著縮短發(fā)酵時間，可以有效地提高設(shè)備利用率以及生產(chǎn)效率［18-20］，該工藝在許多工業(yè)發(fā)酵過程中都得到了廣泛的應(yīng)用。

在控制殘?zhí)?～10 g/L的補(bǔ)料策略基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵，即將上一次發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液留下10%體積作為種子加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵或者取出10%體積發(fā)酵液至另一個發(fā)酵罐中繼續(xù)進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵。反復(fù)分批發(fā)酵進(jìn)行了4個批次，發(fā)酵過程曲線如圖5所示。由圖5可知:整個發(fā)酵持續(xù)了20 d，4批發(fā)酵細(xì)胞干質(zhì)量分別是29.73、31.42、30.54和32.72 g/L。油脂含量穩(wěn)定在50%左右，與前面的補(bǔ)料分批發(fā)酵以及分批發(fā)酵相比沒有明顯的變化，每一批發(fā)酵周期都是5 d，葡萄糖剛耗完時繼續(xù)下一批發(fā)酵，ARA含量分別是42.81%、43.17%、42.30%和39.71%，到第4批時ARA含量略微下降，第4批結(jié)束后沒有進(jìn)一步發(fā)酵，可能發(fā)酵培養(yǎng)液活力已經(jīng)不夠，菌種性能降低。因此，考察此過程中的菌絲形態(tài)變化情況，結(jié)果見圖6。由圖6可知:越到后期菌球形成的顆粒越大，菌球內(nèi)部呈空狀，表面呈致密結(jié)構(gòu)，這可能造成傳質(zhì)和傳氧受限制，導(dǎo)致ARA含量降低。同時還發(fā)現(xiàn)以上一批發(fā)酵液作為種子，種子抗剪切能力增強(qiáng)，攪拌轉(zhuǎn)速前期就可以設(shè)定在180 r/min，菌絲體不會打碎。因此，不需要在發(fā)酵過程中改變轉(zhuǎn)速，操作更簡單。

圖5 ARA油脂反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)程Fig.5 Process of ARA-rich oil repeated fed-batch fermentation

圖6 ARA油脂反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵各批次形態(tài)Fig.6 Morphology of every batch in repeated fed-batch fermentation

2.4 不同補(bǔ)料方式對ARA油脂生產(chǎn)的對比

表1為不同補(bǔ)料培養(yǎng)方式下ARA發(fā)酵結(jié)束后各項發(fā)酵指標(biāo)的對比結(jié)果。由表1可知:細(xì)胞干質(zhì)量、油脂質(zhì)量濃度及ARA含量下，差別不顯著，細(xì)胞干質(zhì)量基本穩(wěn)定在30 g/L左右，油脂含量和油脂質(zhì)量濃度也基本維持在50%和15 g/L左右，ARA含量除了反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的第4批(由于種子活力下降)在40%以下外，其余均在40%以上。從表1中還可以看到，變化最明顯的是發(fā)酵周期和生產(chǎn)強(qiáng)度，發(fā)酵周期由最初的分批發(fā)酵7 d降至5 d，生產(chǎn)強(qiáng)度由最初的0.93 g/(L·d)，提高到1.33 g/(L·d)，提高近45%。綜合考慮細(xì)胞干質(zhì)量、油脂含量、ARA產(chǎn)量和ARA生產(chǎn)強(qiáng)度等方面的因素，最終確定初糖質(zhì)量濃度在20 g/L，發(fā)酵過程糖質(zhì)量濃度控制在5～10 g/L是M.alpina R807發(fā)酵生產(chǎn)ARA最佳的補(bǔ)料培養(yǎng)方式。

表1 不同補(bǔ)料方式下ARA油脂發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 1 Comparison of results for ARA-rich oil production under different cultivation strategies

3 結(jié)論

根據(jù)ARA油脂工業(yè)化生產(chǎn)的可操作性，考察了不同殘?zhí)欠答伭骷庸に噷Ω呱奖绘呙巩a(chǎn)ARA油脂的影響。對比不同的殘?zhí)欠答伭骷庸に嚕l(fā)現(xiàn)初糖質(zhì)量濃度為20 g/L，發(fā)酵過程糖質(zhì)量濃度控制在5～10 g/L是M.alpina R807發(fā)酵生產(chǎn)ARA油脂最佳的補(bǔ)料方式。與分批發(fā)酵相比，雖然細(xì)胞干質(zhì)量、油濃度、ARA含量及ARA濃度變化不顯著，但是發(fā)酵周期縮短2 d，ARA生產(chǎn)強(qiáng)度提高近45%，這是目前ARA油脂發(fā)酵報道的最短發(fā)酵周期。在補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，建立了一種反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝，培養(yǎng)1次，種子可以反復(fù)進(jìn)行4次發(fā)酵，最終ARA含量都超過38%。由于只需1次菌種活化及種子培養(yǎng)，就可以進(jìn)行多個批次的發(fā)酵，顯著縮短發(fā)酵時間，可以有效地提高設(shè)備利用率以及生產(chǎn)效率。

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