南極假絲酵母脂肪酶B催化3-(4-氟苯基)戊二酸酐不對稱醇解

賈義剛1,楊震炯2,劉維明1,張洋1,黃和1,胡燚1

(1. 南京工業(yè)大學材料化學工程國家重點實驗室,江蘇南京210009；

2. 永康市質(zhì)量技術監(jiān)督檢測中心,浙江永康321300)

摘要：采用分子模擬技術，研究了南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B，CALB)催化3-(4-氟苯基)戊二酸酐(3-FGA)不對稱醇解的分子機制。首先借助力場修改的Autodock 4.2軟件將過渡態(tài)底物與CALB進行對接，根據(jù)對接自由能差異解析了CALB催化3-FGA與不同醇反應的立體選擇性差異,得到的S型底物結合能小于R型底物；其次，基于扭轉角機制分析發(fā)現(xiàn)，S型底物扭轉角小于R型底物，從分子水平上揭示了CALB對S型底物選擇性優(yōu)于R型底物的機制。

關鍵詞：南極假絲酵母；脂肪酶； 3-(4-氟苯基)戊二酸酐；分子對接；分子動力學；對映選擇性

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.04.011

收稿日期：2014-09-06

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2011AA02A209)

作者簡介：賈義剛(1989—)，男，山東濟陽人，碩士研究生，研究方向：生物催化;胡燚(聯(lián)系人)，教授 ，E-mail:huyi@njtech.edu.cn

中圖分類號：Q71文獻標志碼：A

Enantioselective alcoholysis of 3-(4-fluorophenyl)glutaric anhydride catalyzedbyCandidaantarcticalipase B

JIA Yigang1,YANG Zhenjiong2,LIU Weiming1,ZHANG Yang1,HUANG He1,HU Yi1

(1. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Enqineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China;

2. Quality and Technical Supervision and Inspection Center of Yongkang City,Yongkang 321300,China)

Abstract：We studied enantioselective alcoholysis of 3-(4-fluorophenyl) glutaric anhydride(3-FGA) by Candida antarctica lipase B(CALB) through molecular simulation technology. The transition state substrates were docked with CALB by using Autodock 4.2 whose force file was modified. The enantioselective difference of the alcoholysis of 3-FGA with various alcohols catalyzed by CALB was proved by the differences of binding energy. The binding energy of S-enantiomer was smaller than R-enantiomer. Furthermore,we also found that the torsional angle of S-enantiomer was smaller than R-enantiomer through analyzing the torsional angle mechanism, CALB showed an S-enantiomer enantiopreference from the molecular level.

Keywords：Candida antarctica; lipase; (3-(4-fluorophenyl)glutaric anhydride; molecular docking; molecular dynamics; enantioselectivity

手性3-(4-氟苯基)戊二酸單酯是一種重要的藥物中間體，可用于合成抗抑郁藥帕羅西汀以及P2X7受體抑制劑[1-3]。酶法因其催化效率高、立體選擇性強和反應條件溫和等優(yōu)點而被廣泛應用于手性單酯的合成。目前，酶法制備3-氟苯基戊二酸單酯的方法主要是脂肪酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二酯的不對稱水解和3-(4-氟苯基)戊二酸酐(3-FGA)的不對稱醇解[4-6]。在前期工作中，筆者所在課題組的Liu等就南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)催化3-FGA的不對稱醇解反應的工藝條件進行了系統(tǒng)研究，在研究中發(fā)現(xiàn)，當采用不同鏈長和結構的醇作為?；荏w與3-FGA反應時，脂肪酶表現(xiàn)出不同的催化性能，如脂肪酶活性和選擇性隨?；荏w鏈長增加而降低。然而，目前CALB在采用不同鏈長的醇作為酰基受體時表現(xiàn)出的對映選擇性差異機制尚不清楚，近年來，分子模擬作為一種輔助技術，為酶的催化機制解析提供了強大支持[8-9]。

為此，從分子模擬的角度對3-(4-氟苯基)戊二酸酐的去對稱醇解反應進行研究，從分子水平解析酶催化3-FGA去對稱醇解的分子機制，揭示酶與不同醇之間的相互作用，對研究醇解反應具有重要的意義。

1材料與方法

1.1分子對接

1.1.1受體酶分子準備

CALB的pdb結構從蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫RCSB(Protein Data Bank,PDB)獲取(PDB ID:1TCA)。首先利用Autodock 4.2刪除晶體結構中水分子，添加缺省的H及其原子的部分電荷；為了保證對接過程真實于反應條件，筆者采用過渡態(tài)對接，將活性中心的絲氨酸Ser質(zhì)子化，刪除—OH中的H原子，并利用RESP對其電荷分布重新擬合(電荷:-1)。將處理后的結構保存為pdbqt格式，以備下一步對接工作。

1.1.2配體的準備

利用ChemOffice 3D 軟件構建過渡態(tài)底物。在構建的過渡態(tài)底物過程中，將其羰基中的O 原子設置成帶一個單位負電荷。進而，利用MM2 模塊對底物結構進行能量最小化。用Chimera1.8添加缺省的氫原子及部分原子電荷，并手動刪除底物上與?；荏w相連的羰基O原子的H原子，得到分子總電荷為-1，保存為mol2格式，以備下一步工作使用。

1.1.3力場修改

為實現(xiàn)底物與受體CALB活性口袋部位的成功對接，底物與受體必須滿足四面體過渡態(tài)對接條件?？紤]到過渡態(tài)對接時,配體分子中羰基的O原子遠離Thr40氧負離子,無法形成氫鍵，因而對配體絲氨酸的OG 與配體CT 的范德華力(vdW) 及范德華勢能ε參數(shù)進行修正。一方面，通過減小OG與CT的間距來降低OG和CT的范德華作用，另一方面，通過OG 和CT 的相互作用力提高范德華勢能ε值，以降低對接勢能。本研究最終將絲氨酸OG原子的原子類型改為非鍵類型，范德華參數(shù)修正：ε=2.93×105J、半徑σ=0.15 nm；對接過程中，所有配體分子的CT 原子范德華參數(shù)修正為ε=1.26×105J、半徑σ=0.15 nm；同時，受體與配體分子的O1、O2 原子形成的氫鍵ε值修正為1.26×105J[10-11]。

1.1.4底物對接

本文采用半柔性對接方式，對接過程中配體小分子的可旋轉鍵由系統(tǒng)自動分配，但受體酶為剛性結構。在對接前，設置4.0 nm×4.0 nm×4.0 nm 大小的搜索網(wǎng)格，其格點步長為0.037 5 nm，盒子中心為Ser105的OG 原子坐標(坐標：-7.320，22.766，16.938)，其他參數(shù)默認。通過拉馬克(Lamakian) 遺傳算法獲得100個最優(yōu)的對接構象。根據(jù)文獻[11]報道，筆者設定一個篩選條件作為構型篩選標準：①絲氨酸的OG原子與羰基的CT原子之間的鍵長小于0.2 nm；②配體分子必須與“氧負離子洞”形成2個的氫鍵；③配體分子與His224的咪唑環(huán)NE2原子形成1個氫鍵。

1.2分子動力學模擬

采用Gromacs 4.5.4軟件進行分子動力學模擬，具體操作如下：采用Prodrg進行處理對接底物力場參數(shù)[12-13]。所有模擬過程均在pH7.0、溫度300 K 下，GROMOS96 53a6力場、SPC216水模型、PME(particle mesh Ewald) 算法處理靜電作用、遠程靜電截斷值為1.2 nm、遠程范德華力的截斷值為1.2 nm，進行15 ns動力學模擬。體系采用立方體盒子，每個模擬周圍填充1.0 nm 的水分子，模擬體系首先采用1 000 步的能量最小化；之后進行壓力與溫度平衡模擬500 ps；最后進行分子動力學模擬，放松蛋白，進行非限制性模擬。等壓模擬體系下，溫度模擬采用V-rescale 算法，耦合常數(shù)為0.1 ps。動力學模擬的數(shù)據(jù)借助OriginPro 8.0處理分析。

2結果與討論

2.1對接結果分析

與其他脂肪酶一樣，脂肪酶CALB活性口袋由底物?；糠纸Y合的疏水性口袋和醇基部分結合的親水性口袋兩部分組成，CALB對S型底物選擇性與底物的醇基部分能否分布在親水性口袋有關，如圖1所示。

圖1　 底物(?；荏w甲醇)在活性腔中的分布 Fig.1　 Distribution of substate(acyl acceptor methanol) in the active site

利用分子對接，分別將5種不同的手性醇過渡態(tài)底物對接到酶的活性口袋，考察其對接結合能數(shù)據(jù)，結果見表1。由表1可知：CALB對不同底物的S構型優(yōu)于R型構象，這一現(xiàn)象與之前課題組實驗數(shù)據(jù)報道相一致(表1)。

表1　3-FGA與不同酰基受體的去對稱作用及結合能

由表1可知：CALB對3-FGA的S型構象底物具有優(yōu)先選擇性。隨著碳鏈的增長，轉化率和對映體消旋(e.e.)值逐漸降低，這可能是由于構成活性口袋的殘基對長鏈底物更易形成空間位阻，使酶不能很好地分布在活性口袋，導致轉化率和e.e.值降低。從結合能發(fā)現(xiàn)，?；荏w丁醇底物小于丙醇底物，由于空間位阻，使?；荏w1-丁醇的CT原子更靠近Ser105上的OG原子，導致氫鍵OG—CT=0.16 nm小于?；嫉孜镄纬傻臍滏IOG—CT=0.21 nm，進而結合能低于酰基丙醇底物。同樣，林明等[10]在研究洋蔥假單胞菌脂肪酶去對稱水解N-(2-甲基-6-乙基苯基) 丙氨酸(NEMPA)制備R-NEMPA時認為醇解部分相對較窄，對底物的選擇性強，而酰基部分則相對較弱。為了從動態(tài)上進一步研究CALB對底物選擇性差異，筆者采用分子動力學就底物與口袋動態(tài)結合情況進行研究。

2.2動力學分析

根據(jù)文獻報道，一些研究者認為底物與酶形成復合物的扭轉角對酶選擇性具有很大影響(圖2)。如Jung等[14]研究CALB催化手性3-苯基戊二酸二元酯過渡態(tài)底物時發(fā)現(xiàn)R型底物與酶形成扭轉角為0°(O—H—O 或N—H—O)，小于S型底物與酶形成的扭轉角60°。因而，筆者又將對接最優(yōu)構象復合物進行了15 ns的分子動力學模擬。其中，選取了甲醇與乙醇為代表來研究扭轉角與選擇性的關系。

圖2　 酶與配體扭轉角圖 Fig.2　 Torsional angle for enzyme and substrate

首先對?；荏w甲醇和乙醇復合物進行Cα均方根偏差(RMSD)15 ns分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)，整個體系波動較小，且都在5 ns后達到平衡狀態(tài)，見圖3和4。由圖3和4可知：甲醇的RMSD約為0.2 nm,乙醇體系的RMSD約為0.18 nm。通過RMSD分析說明，平衡后的復合物的結構構象已趨向穩(wěn)定、合理。而在扭轉角分析中，對于酰基受體甲醇，體系約在5 ns平衡。模擬結果發(fā)現(xiàn)，S型構象底物與酶的扭轉角度約為90°,而R型底物則為110°。而?；荏w乙醇體系在5 ns平衡后的S型底物扭轉角度約為60°,R型底物扭轉角為150°(圖5)，基于兩者發(fā)現(xiàn)S型底物的扭轉角度明顯小于R型底物。

圖3　 ?；荏w甲醇RMSD Fig.3　 RMSD of acyl acceptor methanol

圖4　 酰基受體乙醇RMSD Fig.4　 RMSD of acyl acceptor ethanol

圖5　 分子動力學模擬?；荏w扭轉角 Fig.5　 The simulation of torsional angle of acyl acceptor with molecular dynamics

3結論

基于分子模擬技術對CALB催化3-FGA的去對稱醇解反應研究，通過結合能差異分析了酶與不同鏈長的醇去對稱醇解的對映選擇性差異，發(fā)現(xiàn)S型底物結合能小于R型底物。同時通過分子動力學模擬分析了扭轉角與不同醇對映選擇性的分子機制，證實S型底物與酶形成的復合物扭轉角小于R型底物。但是目前的模擬研究并不能證實哪幾個氨基酸在選擇性中起關鍵性作用，有必要在今后的研究中引入量子力學及MM-GBSA，對氨基酸的能量效應進行分析，確定對映選擇性的關鍵氨基酸，理性指導優(yōu)化酶的性能。

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(責任編輯荀志金)