王從平，賈敏，李文靜，朱祖欣，劉群會(huì)

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北恩施445000）

大豆磷脂對(duì)多發(fā)性腦梗死大鼠恢復(fù)期谷氨酸、γ-氨基丁酸含量及NMDA受體表達(dá)的影響

王從平，賈敏，李文靜，朱祖欣，劉群會(huì)

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北恩施445000）

目的研究大豆磷脂對(duì)多發(fā)性腦梗死大鼠恢復(fù)期腦組織中谷氨酸（Glu）與γ-氨基丁酸（GABA）的含量及N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體各亞型表達(dá)的影響。方法對(duì)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈給予注射微球血管栓塞劑，建立大鼠多發(fā)性腦梗死模型，于腦梗死10 d后給予不同劑量的大豆磷脂，連續(xù)干預(yù)60 d。采用電子透射顯微鏡觀察并記錄腦組織的超微病理結(jié)構(gòu)變化，采用高效液相色譜法分析腦組織中Glu和GABA的含量，采用免疫組化法分析腦組織中NMDA的受體各亞型，包括NR1，NR2A及NR2B的表達(dá)變化情況。結(jié)果與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠的恢復(fù)期腦組織的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及突觸的超微結(jié)構(gòu)均有變化，神經(jīng)遞質(zhì)Glu與GABA的表達(dá)均明顯減少，而NMDA的受體各亞型NR1，NR2A及NR2B的表達(dá)則明顯增加。結(jié)論大豆磷脂能改善大鼠多發(fā)性腦梗死恢復(fù)期腦組織的超微結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)Glu與GABA的合成分泌，抑制NMDA的受體各亞型NR1，NR2A和NR2B的表達(dá)，在一定程度上起到保護(hù)神經(jīng)的作用。

大豆磷脂；多發(fā)性腦梗死；恢復(fù)期；N-甲基-D-天門冬氨酸受體

腦缺血的發(fā)病機(jī)制涉及到自由基攻擊、鈣離子超載、繼發(fā)性炎性反應(yīng)及興奮性神經(jīng)毒反應(yīng)等聯(lián)合作用，病理學(xué)較復(fù)雜，主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞受損或腦部功能性障礙［1］。大鼠發(fā)生腦缺血約30 d后會(huì)出現(xiàn)腦組織受損的連續(xù)病理學(xué)變化，提示腦組織發(fā)生缺血后需及時(shí)采取積極有效的治療方案以減輕缺血性損傷［2］。N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR）在腦組織處于缺血缺氧狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性效應(yīng)，進(jìn)一步引發(fā)腦缺血受損，由于該神經(jīng)毒性受谷氨酸（Glu）與γ-氨基丁酸（GABA）所誘導(dǎo)，故對(duì)其進(jìn)行干預(yù)可保護(hù)缺血半暗帶的腦組織，加速腦功能的恢復(fù)［3］。腦梗死時(shí)，腦內(nèi)的磷脂酶將被激活，其可分解磷脂使其含量下降，大豆磷脂可補(bǔ)充腦梗死大鼠腦內(nèi)下降的磷脂，抑制腦部局灶性腦梗死大鼠腦中的Glu與GABA的分泌釋放，從而達(dá)到保護(hù)腦組織的作用［4］，但對(duì)于處于多發(fā)性腦梗死的恢復(fù)期，其是否還具有同樣的調(diào)節(jié)作用，需作進(jìn)一步探討。本研究中建立了多發(fā)性腦梗死大鼠模型，分析了大豆磷脂對(duì)腦組織中Glu和GABA的釋放及NMDA受體的表達(dá)影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試藥：大豆磷脂（黑龍江三江油脂廠，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)按1995年版《美國(guó)藥典》中卵磷脂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）。鹽酸美金剛片（丹麥靈北藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H20120268）；海藻酸鈉微球血管栓塞劑（KMG，北京圣醫(yī)耀科技公司，批號(hào)為20093770407）。免疫組化用一抗為NMDAR1（型號(hào)NBP1-20085）、NMDAR2A（型號(hào)NBP1-21459）、NMDAR2B（型號(hào)R-1001-100），均為兔抗大鼠的多抗，由美國(guó)NovusBiologicals公司生產(chǎn)；枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽（PBS）緩沖液、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）及二抗（型號(hào)PV-6000）均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）。

主要儀器：電化學(xué)高效液相色譜儀及工作站（包括16通道Coularray陣列、542自動(dòng)進(jìn)樣器、582泵、5600A電化學(xué)檢測(cè)器及6210碳石墨電極）；可控溫元件（型號(hào)CTO-324，美國(guó)ESA公司）；低溫冷凍離心機(jī)（型號(hào)IECCL31R，美國(guó)Therm公司）；電子透射顯微鏡（型號(hào)H7500，日本日立公司）；顯微鏡（型號(hào)Nikon 55I）；水系（0.22μm）微孔濾膜（天津騰達(dá)過(guò)濾器廠）；分析天平（型號(hào)AG2245）與pH計(jì)（型號(hào)TELTA 320，上海Mettler Toledo公司）；切片機(jī)（型號(hào)LEICARM2235）。

動(dòng)物：60只雄性SD大鼠，體重為235～260 g，由北京維通利華有限公司［動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK（京）2002-0011］培育提供。

1.2 動(dòng)物造模與分組

所有動(dòng)物在適應(yīng)性條件下飼養(yǎng)3 d后開始造模。采用3.5%水合氯醛溶液（給藥劑量為0.4 g/kg）給予大鼠腹腔麻醉，頸部去毛并消毒，并于正中作一切口，將頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈分離并將頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端進(jìn)行結(jié)扎，使用動(dòng)脈夾將頸總動(dòng)脈夾閉［5］，頸外動(dòng)脈插管并用注射器由外動(dòng)脈向內(nèi)動(dòng)脈注射0.1mLKMG，使栓子可由內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)到達(dá)大腦的各個(gè)動(dòng)脈，形成多發(fā)性腦梗死［6］。對(duì)于假手術(shù)組的大鼠，由外動(dòng)脈向內(nèi)動(dòng)脈注射0.1mL的0.9%氯化鈉注射液，將動(dòng)脈夾松開，并將頸外動(dòng)脈的近心端結(jié)扎，最后將傷口縫合，回籠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。采用青霉素給予抗感染，次日觀察各組大鼠的行為表現(xiàn)，如大鼠前肢發(fā)生行為學(xué)的則判為建模成功［7］。大鼠造模成功后，按給藥類型不同隨機(jī)均分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、鹽酸美金剛組（C組）及大豆磷脂高劑量和低劑量組（D1組和D2組），各12只。于術(shù)后第10天開始分別采用灌胃給藥的方式給予其蒸餾水、鹽酸美金剛（給藥劑量為20mg/kg）、大豆磷脂（給藥劑量為D2組16.5mg/kg和D1組33.0mg/kg）。每日1次，連續(xù)給藥60 d。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

Glu與GABA含量測(cè)定：采用高效液相色譜-電子化學(xué)檢測(cè)（HPLC-ECD）法測(cè)定大鼠大腦皮層及海馬Glu與GABA的含量［8］。對(duì)大鼠快速斷頭并取腦，將其前皮層及海馬進(jìn)行分離，采用液氮進(jìn)行固化處理，-70℃冰箱保存。然后于每0.1 g的腦組織中加入1mL的低溫工作液，冰浴條件下采用勻漿器勻漿，15 s后在4℃條件下14 000 r/min離心，20 min后取上清液，用0.22μm的濾膜對(duì)上清液過(guò)濾分裝，于-20℃冰箱保存。HPLC測(cè)定條件為MSC18色譜柱（50mm×3.0mm，2.5μm），流動(dòng)相磷酸氫二鈉100mmol/L、20%甲醇、3.5%丙烯腈，pH為（6.70±0.03），流速為0.4mL/min，電勢(shì)為+150mV及+650mV，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。

NMDA受體各亞型表達(dá)量分析：采用免疫組化法分析［9］。于右側(cè)大腦的囟門和囟門后2mm處冠狀切開大腦，取出中間腦組織并固定、包埋、切片及脫蠟至水洗。抗原修復(fù)，采用3%的過(guò)氧化氫處理，15min后水洗，經(jīng)PBS洗滌3次后加入一抗（稀釋比例為1∶100），4℃過(guò)夜孵育，將切片取出放于室溫30 min，經(jīng)PBS洗滌3次后加入二抗，室溫孵育30min后經(jīng)PBS洗滌3次，采用DAB顯色，于鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。經(jīng)水洗、蘇木素復(fù)染、脫水及封片后鏡下觀察。采用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值。

腦組織常規(guī)病理學(xué)觀察：采用免疫組化法制備石蠟切片（厚度均為4μm），經(jīng)HE染色后采用乙醇梯度脫水，二甲苯使之透明并用樹膠封片。于光鏡下對(duì)腦組織的神經(jīng)元壞死、變性、炎性反應(yīng)及小膠質(zhì)細(xì)胞的增生情況進(jìn)行觀察并記錄。

腦組織病理形態(tài)觀察：大鼠處死后，快速將其腦部取出，前皮層切成約1mm3的塊狀并浸入4%的戊二醛磷酸緩沖液（pH為7.2）內(nèi)固定。進(jìn)行PBS沖洗、乙醇梯度脫水、包埋及切片等過(guò)程［10］。將厚度為50 nm的切片經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，采用電子透射顯微鏡觀察神經(jīng)元、神經(jīng)突觸及膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)Glu和GABA含量的影響

結(jié)果見表1。與A組大鼠相比，B組大鼠腦皮層的Glu和GABA含量、海馬的Glu含量均明顯下降（P＜0.05）；給藥60 d后，與B組大鼠相比，C組腦皮層及海馬中的Glu和腦皮層的GABA含量均明顯升高（P＜0.05），D1組及D2組腦皮層及海馬的Glu、D2組腦皮層中的GABA含量均明顯升高（P＜0.05）。

表1 大豆磷脂對(duì)大鼠腦組織中Glu和GABA的含量影響（±s，n=12）

表1 大豆磷脂對(duì)大鼠腦組織中Glu和GABA的含量影響（±s，n=12）

組別A組B組C組D1組D2組腦組織（μg/g）海馬（μg/g）Glu 124.90±56.60 74.10±14.00 154.60±108.30 145.20±49.70 148.30±52.10 GABA 19.90±10.00 12.40±5.20 23.80±17.40 11.20±7.00 17.50±4.80 Glu 110.40±52.80 60.40±23.90 137.50±46.70 104.90±35.30 145.90±56.00 GABA 25.20±17.20 17.90±7.10 19.20±10.70 18.00±12.40 21.20±13.20

2.2 對(duì)NMDA受體各亞型表達(dá)的影響

NMDA各受體亞型包括NR1，NR2A及NR2B在大鼠的前皮層神經(jīng)細(xì)胞胞膜與胞漿發(fā)生著色。與A組大鼠相比，B組大鼠腦組織的NMDA各受體亞型高水平表達(dá)，其積分灰度值（IOD）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B組大鼠相比，C組腦組織的NMDA各受體亞型的表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05）；同時(shí)D1組的腦組織中各受體亞型的表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而D2組則僅有NR1和NR2B 2個(gè)受體亞型的表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 腦組織病理學(xué)變化

經(jīng)腦組織病理學(xué)分析，A組術(shù)側(cè)神經(jīng)元未見變性、壞死或軟化灶，也未發(fā)生小膠質(zhì)細(xì)胞的增生；B組大鼠神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死或軟化灶，伴有小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生重度增生；D1組和C組的神經(jīng)元有變性、壞死或炎性細(xì)胞反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生輕度增生，但軟化灶不明顯；D2組大鼠神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死或軟化灶，間質(zhì)炎細(xì)胞反應(yīng)較輕度，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生中度增生。

2.4 對(duì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)突觸形態(tài)學(xué)的影響

通過(guò)顯微鏡觀察，A組大鼠的神經(jīng)元形態(tài)較完整，細(xì)胞器豐富，可觀察到大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及線粒體，且線粒體的嵴較完整；B組大鼠的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的水腫現(xiàn)象，細(xì)胞器的數(shù)量也明顯下降，線粒體的嵴絕大部分出現(xiàn)了融合或模糊不清的現(xiàn)象，空泡化較明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了明顯的脫顆粒現(xiàn)象；D1組的神經(jīng)元細(xì)胞的線粒體部分嵴發(fā)生少量融合或模糊不清，少數(shù)嵴發(fā)生斷裂或缺失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度的脫顆粒現(xiàn)象，游離核糖體也有減少。

從形態(tài)學(xué)看來(lái)，A組大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞器和細(xì)胞核大小及形狀均正常，線粒體的嵴較完整；B組大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的大部分嵴已模糊不清，部分發(fā)生缺失、空泡甚至斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中也有顆粒融合或者脫顆粒的現(xiàn)象；D1組的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其胞內(nèi)線粒體的部分嵴模糊不清，有的已缺失或斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)了輕度的脫顆粒。

A組大鼠的突觸表現(xiàn)正常；B組的突觸間隙表現(xiàn)為模糊不清，突觸小泡減小，突觸前呈明顯的水腫，線粒體表現(xiàn)異常；D1組的突觸前線粒體呈明顯的空化，部分膜發(fā)生融合，模糊不清，且突觸小泡減少，但間隙較清楚。

3 討論

發(fā)生腦梗死時(shí)，腦中的磷脂酶會(huì)被激活，可將磷脂分解為游離的脂肪酸，使細(xì)胞膜受損，細(xì)胞內(nèi)、外的物質(zhì)交換及能量代謝將受到影響。維持細(xì)胞膜的完整性及其正常的生理功能需使腦內(nèi)的磷脂含量維持在一個(gè)合適的水平［11］。抑制腦梗死患者腦內(nèi)磷脂含量降低的措施較多，傳統(tǒng)方法常采用磷脂酶A2的抑制劑，如磷脂酶C抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF），但其特異性較差，不良反應(yīng)較大。胞二磷膽堿在體內(nèi)可生成膽堿而促進(jìn)腦中磷脂酰膽堿的合成，從而減少腦中的磷脂含量。在治療腦梗死時(shí)，大豆磷脂對(duì)患者的神經(jīng)功能缺損具有顯著的改善作用，臨床療效較明顯［12］。

Glu作為動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，可有效激活脊髓神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元的電生理活動(dòng)，通過(guò)激活相應(yīng)受體而對(duì)神經(jīng)元的分化、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的偶聯(lián)均有重要的作用［13-14］。本研究中，通過(guò)觀察神經(jīng)系統(tǒng)的超微結(jié)構(gòu)和腦部組織中Glu與GABA的含量變化，可看出在多發(fā)性腦梗死恢復(fù)期的過(guò)程中，腦缺血缺氧引發(fā)的神經(jīng)元中線粒體的呼吸功能減退而使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)功能性障礙，進(jìn)而引起腦部功能性障礙。

NMDA受體作為興奮性氨基酸受體，在靜息狀態(tài)下，Mg2+結(jié)合于通道上以阻止Ca2+內(nèi)流［15］。當(dāng)腦組織發(fā)生缺血缺氧時(shí)，會(huì)引發(fā)細(xì)胞膜的去極化，Mg2+對(duì)NMDA受體的阻滯作用被削弱，NMDA受體被活化，Ca2+大量?jī)?nèi)流而使神經(jīng)元受損，加大了Glu的興奮性毒性，可通過(guò)阻斷NMDA受體來(lái)干預(yù)谷氨酸的興奮性毒性作用，避免對(duì)神經(jīng)元的損傷［16］。本研究結(jié)果表明，模型組的腦部神經(jīng)元的NMDA各受體亞型NR1，NR2A及NR2B的表達(dá)均較高?？梢娫诙喟l(fā)性腦梗死恢復(fù)期時(shí)NMDA受體的高表達(dá)可破壞神經(jīng)元。因此，通過(guò)控制神經(jīng)遞質(zhì)Glu和GABA的表達(dá)水平及NMDA的受體表達(dá)，可減緩腦梗死恢復(fù)期的神經(jīng)元受損，促進(jìn)腦功能的恢復(fù)。

本研究中采用大豆磷脂治療多發(fā)性腦梗死恢復(fù)期的大鼠，結(jié)果表明，其可使腦組織中Glu與GABA的含量升高，還可下調(diào)NMDA受體的表達(dá)，證實(shí)大豆磷脂可促進(jìn)中樞神經(jīng)功能的恢復(fù)，還可減緩神經(jīng)元受損。其作用機(jī)制可能為：大豆磷脂主要成分是磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺，這些組分可被磷脂酶分解；發(fā)生腦梗死時(shí)，梗死的部位能量被大量耗竭，由膽堿合成磷脂酰膽堿的代謝受阻，且隨缺血程度的加重，代謝更加困難，而大豆磷脂中各磷脂成分屬于完整的磷脂，無(wú)需耗能即可合成，其進(jìn)入機(jī)體即被磷脂酶分解，然后可添補(bǔ)細(xì)胞膜缺損，使缺血部位的磷脂含量不至減少過(guò)多，保持了細(xì)胞膜的完整性，大大減緩了磷脂酶對(duì)神經(jīng)元的損傷。

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Effect of Soybean Lecithin on Content of G lu，GABA and Expression of NMDA Receptor Subtypes in Recovery Period of Multiple Cerebral Infarction Rats

Wang Congping，Jia Min，Li Wenjing，Zhu Zuxin，Liu Qunhui
（Department of Neurology，The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture，Enshi，Hubei，China 445000）

Objective To analyze the effects of soybean lecithin on levels of Glu，GABA and the expression of NMDA receptor subtypes in recovery period of multiple cerebral infarction rats.Methods To establish multi-infarct model rats by injecting embolizing micro-sphere via internal carotid artery，10 d after cerebral infarction，different content of soybean lecithin were given for the treatment for 60 d. The pathological changes of brain ultrastructure were observed and recorded by electron transmission microscope.The expression levels of Glu and GABA of brain tissue were measured and analyzed with HPLC.And the expression of NMDA receptors of each subtypes including NR1，NR2A and NR2B in neurons was measured by immune histochemical staining.Results Compared with the rats of sham there were some abnormal changes in the ultra structures of neurons and neuroglia cells and synapses of the model rat，the levels of Glu and GABA decreased significantly，but the expression of NR1，NR2A and NR2B increased significantly.Conclusion Soybean lecithin can improve the ultra structure of cerebral tissue，facilitate synthesis the levels of Glu and GABA，and induce the expression of subtypes of NR1，NR2A and NR2B in neurons，and it has neuroprotective effect.

Soybean lecithin；multiple cerebral infarction；recovery period；NMDA receptor

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0085-04

王從平（1974-），男，土家族人，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟X血管疾病的診治，（電子信箱）wcp0413@ 163.com。

2015-06-17）