張慶明，張平，徐云燕，蘇華

（中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇南京210002）

黃柏藥材中生物堿類(lèi)多成分的含量測(cè)定

張慶明，張平，徐云燕，蘇華

（中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇南京210002）

目的建立同時(shí)測(cè)定黃柏藥材生物堿類(lèi)多成分含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法。方法色譜柱為Waters XBridge C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸水（含0.02mol/L磷酸二氫鈉）-乙腈（3∶1）等度洗脫，流速為1mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。結(jié)果生物堿類(lèi)成分進(jìn)樣量鹽酸小檗堿在0.880 0～13.200 0μg（n=6），鹽酸巴馬汀在0.003 8～0.060 8μg（n=6），鹽酸藥根堿在0.003 2～0.051 2μg（n=6）范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好；三者平均加樣回收率分別為96.23%，98.32%，96.44%，RSD分別為0.38%，0.56%，1.15%（n=6）。結(jié)論該法能同時(shí)測(cè)定黃柏藥材中小檗堿、巴馬汀、藥根堿生物堿類(lèi)成分的含量，可有效控制黃柏藥材的質(zhì)量。

高效液相色譜法；黃柏；生物堿類(lèi)；鹽酸藥根堿；鹽酸巴馬汀；鹽酸小檗堿

黃柏為常用中藥材，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，習(xí)稱(chēng)川黃柏，為蕓香科植物黃皮樹(shù)Phellodendron chinese Schneid.的干燥根皮［1］。黃柏所含活性生物堿成分主要有小檗堿、藥根堿、巴馬汀［2-3］，但黃柏藥材及含黃柏中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量均僅以小檗堿的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。由于小檗屬多種植物中均富含上述成分，故上述方法難以有效控制黃柏藥材的質(zhì)量。為客觀評(píng)價(jià)和控制黃柏的質(zhì)量，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定黃柏中小檗堿、巴馬汀、藥根堿生物堿類(lèi)3種成分的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

2695型高效液相色譜儀，包括2998型二極管陳列檢測(cè)器，Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；LC-20A型液相色譜儀，包括Sartorius BT125D型；EPED超純水系統(tǒng)（日本島津公司）。鹽酸小檗堿（批號(hào)為110713-200609）、鹽酸藥根堿（批號(hào)為110732-200506）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)為0733-200005）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為超純?nèi)ルx子水，其余試劑均為分析純；7批不同產(chǎn)地黃柏樣品由江蘇省中藥研究院生藥室采集，經(jīng)鑒定為原植物為Phellodendron chinese Schneid.。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水（含0.02mol/L磷酸二氫鈉）-乙腈（3∶1），等度洗脫；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液制備

精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，分別制成含0.90 g/L鹽酸小檗堿、0.20 g/L鹽酸藥根堿、0.15 g/L鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液。取干燥黃柏樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.4 g，精密稱(chēng)定，置100mL容量瓶中，加入80mL 60%乙醇，超聲處理45min，冷卻，60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置，過(guò)濾，取續(xù)濾液過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察：分別精密移取鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液1～50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成鹽酸藥根堿含量為0.003 8 g/L、鹽酸巴馬汀為0.003 2 g/L的混合對(duì)照品溶液，搖勻靜置，在擬訂色譜條件下分別進(jìn)樣1，2，4，8，16，20μL，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取鹽酸小檗堿貯備液，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣1，3，7，10，15，20μL，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，mg）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得回歸方程及線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 3種成分回歸方程及線(xiàn)性范圍（n=6）

精密度試驗(yàn)：分別精密移取鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置。在擬訂色譜條件下進(jìn)樣8μL，重復(fù)6次。結(jié)果的RSD分別為0.30%，0.35%，0.45%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取5份同批次黃柏樣品粉末0.4 g，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件進(jìn)樣8μL測(cè)定。結(jié)果的RSD分別為1.50%，1.70%，1.83%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，3，8，24 h時(shí)進(jìn)樣8μL測(cè)定。結(jié)果的RSD分別為1.51%，1.64%，0.53%（n=4），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取5份已知含量的同一批次黃柏樣品約0.1，0.2，0.2 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液4mL，鹽酸藥根堿對(duì)照品貯備液300μL，鹽酸藥根堿對(duì)照品貯備液150μL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣8μL測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

稱(chēng)取各批次樣品0.4 g，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，分別精密吸取8μL，注入液相色譜儀，以外標(biāo)法計(jì)算黃柏中3種成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿及鹽酸巴馬汀加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 不同產(chǎn)地黃柏中3種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

提取溶劑的選擇：考察了甲醇、乙腈（V/V）、60%乙醇3種提取溶劑的提取效果。峰面積測(cè)定結(jié)果表明，60%乙醇對(duì)小檗堿、巴馬汀、藥根堿的提取效果明顯優(yōu)于甲醇及乙腈，最終采用60%乙醇作為提取溶劑。

提取方法的選擇：考察了超聲提取、加熱回流提取和索氏提取3種提取方法。結(jié)果超聲提取45min的樣品各峰面積均大于加熱回流提取1，2，3 h的樣品峰面積，而索氏回流提取8 h的提取效果并未明顯高于超聲提取，最終選擇超聲提取45min。

流動(dòng)相條件的考察：在水相為純水的條件下，各峰不能得到良好的分離且峰形拖尾嚴(yán)重，將水相條件調(diào)整為0.1%（V/V）磷酸溶液后，各峰峰形有明顯改善，但分離效果仍不理想。在0.1%（V/V）磷酸溶液中加入磷酸二氫鈉適量，配制成0.02mol/L的磷酸二氫鈉緩沖溶液后，各峰分離度均大于1.5，達(dá)到分離要求。

方法學(xué)考察及7批黃柏樣品中3種成分的含量測(cè)定結(jié)果表明，該法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)，為黃柏藥材的質(zhì)量控制提供了較好的依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：214.

［2］肖培根.新編中藥志［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：664-670.

［3］李峰，賈彥竹.黃柏的臨床藥理作用［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2004，16（2）：191.

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0082-02

張慶明，男，在讀碩士研究生，助理工程師，執(zhí)業(yè)藥師，（電子信箱）zhangqingming025@163.com；蘇華，女，碩士研究生，主管藥師，執(zhí)業(yè)藥師，本文通訊作者，（電子信箱）suhuash@ sina.com.cn。

2014-12-29；

2015-05-30）