楊美麗，張少杰，楊金蕊，張艷慧，段康飛

（河北省保定市食品藥品檢驗所，河北保定071051）

決明子的特征圖譜研究及質量分析

楊美麗，張少杰，楊金蕊，張艷慧，段康飛

（河北省保定市食品藥品檢驗所，河北保定071051）

目的研究決明子的高效液相色譜（HPLC）特征圖譜，為科學評價省評價性抽驗品種決明子的質量現(xiàn)狀提供依據(jù)。方法特征圖譜采用Waters SunFireTMC18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈-磷酸溶液為流動相梯度洗脫。色譜數(shù)據(jù)采用相似度評價軟件分析并對結果進行聚類分析，探討特征圖譜與質量的相關性。結果分別建立了決明及炒決明的HPLC特征圖譜；聚類分析結果表明，市場上的決明子質量參差不齊，相似度與現(xiàn)行藥典標準含量測定合格率有很大相關性。結論決明子總體質量較差，質量標準有待商榷。建立的特征圖譜能清晰反映決明子生品和炮制品的真實質量，可用于該藥的質量控制。

決明子；特征圖譜；質量；評價性抽驗

決明子為豆科植物決明Cassia obtusi folia L.或小決明Cassia tora L.的干燥成熟種子，前者稱大決明子，后者稱小決明子，收載于2010年版《中國藥典（一部）》，具有清熱明目、潤腸通便的功效，用于目赤澀痛、羞明多淚、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結等癥［1-2］。決明子中含蒽醌類、萘駢吡喃酮類、脂肪酸類、氨基酸和無機元素等，主要成分為蒽醌類和萘駢吡喃酮類［1，3］。目前，大多以蒽醌苷元類成分來控制決明子質量［4-9］，2010年版《中國藥典（一部）》收載的含量測定方法是以蒽醌類大黃酚和橙黃決明素為指標，但萘駢吡喃酮類化合物在決明子中含量更高且更具有專屬性［3］。單一或某幾個成分含量的研究不適于對藥材或飲片的整體評價，缺乏對道地性、均一性的控制。中藥特征圖譜反映的是中藥的整體質量信息，體現(xiàn)了中藥作用的整體性，是一種有效的中藥質量分析方法。通過其特征性，能有效地鑒別樣品的真?zhèn)位虍a地；通過對其主要特征峰的面積或比例的標定，能有效控制產品質量［10］。本研究中參考文獻［11-16］建立了測定決明子特征圖譜的高效液相色譜（HPLC）法，以更綜合、全面探索其內在成分，并對全省抽驗的179批次樣品進行了特征圖譜測定及相似度計算，結合含量測定結果分析樣品性狀、特征圖譜及合格率的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000型液相色譜儀（美國賽默飛世爾公司，DAD檢測器）；Shimadzu LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartorius CPA 225D型電子天平（德國賽多利斯集團）。橙黃決明素（批號為111900-201303，含量以99.1%計）；大黃素（批號為110756-200110）、大黃素甲醚（批號為110758-200610）、大黃酚（批號為110796-200310）、大黃酸（批號為110757-200206）、蘆薈大黃素（批號為110795-200806）、決明（批號為1011-9601）、小決明（批號為121544-200501），均購自中國食品藥品檢定研究院；決明子苷、紅鐮霉素龍膽二糖苷購自中國中醫(yī)科學院中藥研究所。乙腈為色譜純，磷酸、甲酸、冰醋酸為分析純，水為娃哈哈飲用純凈水。樣品共179批次，來源于全省11個地市。生產單位涉及64家，其中我省企業(yè)43家（河北安國市29家，省內其他地市14家），外省企業(yè)21家（安徽亳州14家，山東3家，北京2家，吉林、甘肅各1家）。供樣單位涵蓋市、縣、鄉(xiāng)鎮(zhèn)的批發(fā)、零售、醫(yī)療等單位，其中決明子136批次，炒決明子43批次。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFireTMC18柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，梯度見表1；流速：1.0mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 溶液制備

分別取橙黃決明素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、決明子苷及紅鐮霉素龍膽二糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成1mL約含0.1mg的對照品溶液；取樣品粉碎，過3號篩，按粗細粉比例稱取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定質量，超聲提取20min，放至室溫，補足減失的質量，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，以峰面積較大、分離度較好的11號峰（保留時間約42.7min）為參照峰，色譜圖1～26號峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜5.0%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定，以11號峰為參照峰，測定其穩(wěn)定性。結果圖1～26號峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜5.0%，表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批樣品6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，并依法進樣測定。結果以11號峰為參照峰，圖1～26號峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜5.0%，表明方法重復性良好。

2.4 特征圖譜測定

譜圖采集：按擬訂方法及色譜條件對收集的179批樣品的特征圖譜進行測定，其中決明的典型色譜圖見圖1。通過與對照品保留時間和紫外光譜結果的比較，確定特征圖譜中峰8為決明子苷，峰9為紅鐮霉素龍膽二糖苷，峰18為橙黃決明素，峰25為大黃酚，峰26為大黃素甲醚。小決明典型色譜圖見圖2，與決明的色譜圖存在明顯差異（峰12缺失）。由于抽驗樣品中小決明純品太少，其特征圖譜不適于分析本次大批量樣本，故本研究中目前僅制訂了決明的特征圖譜。

對照特征圖譜生成：將樣品按生品（136批）和炒制品（43批）分為兩類，分別選取其中品相優(yōu)良的樣品，決明子10批，炒決明子7批，采用國家藥典委員會主持開發(fā)的中藥特征圖譜相似度評價軟件（2010版）進行分析，分別生成標準譜圖，見圖3。

相似度計算：將樣品分別與標準譜圖進行Mark峰匹配，計算相似度。匹配譜圖見圖4，相似度計算結果見表2和表3。

2.5 特征圖譜聚類分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中系統(tǒng)聚類法中Ward法，選取“平方Euclidean距離”作為度量標準，對所測樣品與標準圖譜的相似度結果進行系統(tǒng)聚類分析。決明子聚類結果將樣品明顯分為4類，見表4。

圖1 決明色譜圖

圖2 小決明色譜圖

圖3 決明子和炒決明子標準譜圖

結合樣品性狀分析，相似度為0.934～0.999的基本為品相優(yōu)良的決明；相似度為0.88～0.925的基本為外形偏長的決明或混有少量小決明的混合品；相似度為0.844～0.877的基本為混有較多量小決明的混合品，小決明占主要比例；相似度為0.78～0.825的為小決明。炒決明子聚類結果將樣品明顯分為5類。見表5。

結合樣品性狀分析，結果基本同決明子。相似度為0.964～0.997的基本為品相優(yōu)良的決明；相似度為0.91～0.923的基本為外形偏長的決明或決明混有少量小決明的混合品；相似度為0.853～0.903的基本為決明混有較多量小決明的混合品，小決明占主要比例；相似度為0.792～0.829的為小決明。編號146的樣品相似度僅為0.716，單獨聚為一類，結合性狀分析，發(fā)現(xiàn)該樣品種皮有裂紋，有的可見胚芽。分析可能種子發(fā)芽后對成分含量影響較大。

圖4 決明子和炒決明子與參照圖譜Mark峰匹配

2.6 決明及小決明特征圖譜差異

決明子來源有決明和小決明。目前市場上多為決明或兩者的混合品。不同來源的決明子特征圖譜存在較明顯的差異（見圖5），主要集中在Ⅰ區(qū)（7～18min），Ⅱ區(qū)（45～49min）及Ⅲ區(qū)附近（64～66min）。從特征圖譜基本能確定決明子品種來源，由相似度可以判斷樣品的優(yōu)劣。對不了解決明子基源的檢驗者判定樣品種屬問題有一定幫助。

3 討論

標準檢驗情況：決明子現(xiàn)行標準為2010年版《中國藥典（一部）》，179批次樣品中48批次符合規(guī)定，合格率為26.82%，131批次不符合規(guī)定，不合格率為73.18%，不合格主要項目為“含量測定”。決明子來源有決明和小決明2種，兩者性狀差異顯著，易區(qū)分；標準中檢驗項目統(tǒng)一規(guī)定，并未分別制訂限度。檢驗發(fā)現(xiàn)，若樣品為決明，“含量測定”合格率較高；而小決明及混合品則不容易達到標準限度。一定程度上反映了樣品質量與現(xiàn)行標準的不協(xié)調，亟需尋求更合理的分析方法，以綜合、客觀地反映決明與小決明的真實區(qū)別，以利于質量標準的提高。

特征圖譜色譜條件的選擇：決明子中主要含有蒽醌類及萘駢吡喃酮類成分，2010年版《中國藥典（一部）》規(guī)定該品種測定蒽醌類大黃酚及橙黃決明素的波長為284 nm。徐義龍等［3］的研究表明，萘駢吡喃酮類成分含量更高且更具有專屬性。采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，紫外吸收峰顯示該類成分的最大吸收波長為278 nm，且該波長下色譜峰數(shù)及響應值均較理想，因此確定278 nm為測定波長。色譜條件優(yōu)化時考察了不同的流動相體系：甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸及乙腈-0.1%冰醋酸，結果乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)色譜峰形好，基線平穩(wěn)，分離度高，因此選用該系統(tǒng)作為特征圖譜的流動相。

特征圖譜相似度與含量的相關性：將179批次決明子樣品按2010年版《中國藥典（一部）》檢驗含量測定項目，結合含量數(shù)據(jù)及性狀分析發(fā)現(xiàn)：含量合格樣品共50批（其中有2批＜總灰分＞不合格），其中45批為決明，與特征圖譜的相似度很高，在0.95以上。藥典設定特征圖譜的相似度一般要求不低于0.90?！昂繙y定”符合藥典規(guī)定的決明子，相似度均在0.95以上，而相似度0.90～0.95之間的，雖品相良好，含量亦不合格，一定程度上反映出現(xiàn)行標準限度設置偏高。

表2 決明子相似度計算結果

表3 妙決明子相似度計算結果

表4 決明子聚類分析分類表

表5 炒決明子聚類分析分類表

圖5 特征色譜圖比較

決明與小決明性狀明顯不同，大黃酚及橙黃決明素含量值亦存在顯著性差異。通過測定小決明對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號為121544-200501）發(fā)現(xiàn)，其含量測定依現(xiàn)行標準檢驗同樣不符合規(guī)定，而決明對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號為1011-9601）符合現(xiàn)行《中國藥典》規(guī)定。決明和小決明需要更深入地考察研究以確定更合理的含量限度。本研究結果顯示，決明子現(xiàn)行質量標準與市場現(xiàn)狀不相協(xié)調。本研究中會進一步考察該品種特性，科學評判藥品質量及標準的可行性。

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Fingerprint and Quality of Semen Cassiae

Yang Meili，Zhang Shaojie，Yang Jinrui，Zhang Yanhui，Duan Kangfei
（Baoding Institute for Food and Drug Control，Baoding，Hebei，China 071051）

Objective To study the HPLC fingerprint of Semen Cassiae for its scientific quality evaluation.Methods Waters SunFireTMC18column（250 mm×4.6 mm，5μm）was adopted with acetonitrile-phosphoric acid water was treated as mobile phase in gradient elution；the chromatogram was analyzed by the traditional Chinese medicine（TCM）fingerprint similarity evaluation software and the similarity result was analyzed by the similarity clustering system.The correlation between fingerprint and quality was explored.Results The fingerprints of Semen Cassiae and its processed products were set up respectively.Cluster analysis results showed the quality in the market had significant difference，the similarity had great relevance with the percent of pass detected according to the current pharmacopoeia standard.Conclusion The overall quality of Semen Cassiae is poor，the quality standards remains open to question.The newly founded fingerprint method can clearly reflect the actual quality of Semen Cassiae and its processed product，and can be used for the quality of Semen Cassiae.

Semen Cassiae；fingerprint；quality；province evaluation sampling

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0075-04

2015-02-05；

2015-07-02）