張玉明倪志華李寶庫

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定　071002；2.河北大學(xué)藥學(xué)院，保定　071002）

桿菌肽產(chǎn)生菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件初步研究

張玉明1倪志華1李寶庫2

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定071002；2.河北大學(xué)藥學(xué)院，保定071002）

桿菌肽在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛，開展菌種篩選工作十分必要。以低濃度桿菌肽為篩選方法，分離得到一株桿菌肽產(chǎn)生菌，鑒定并命名為地衣芽孢桿菌Y822（Bacillus licheninformis Y822）。該菌株發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽時，最適pH為7.0，溶氧能夠促進產(chǎn)物肽積累。將B. licheninformis Y822傳代5次，分別進行發(fā)酵試驗，可得到（783.51±7.34）U/mL桿菌肽，其中A組分占（75.04±0.83）%。B. licheniformis Y822桿菌肽產(chǎn)量較高，生產(chǎn)能力穩(wěn)定，并且產(chǎn)物中桿菌肽A組分含量高，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。

地衣芽孢桿菌；桿菌肽；分離；鑒定

桿菌肽是由地衣芽孢桿菌（Bacillus lichnifarimis）或枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵產(chǎn)生的一種多肽類廣譜抗菌素，具有抗菌譜廣、不產(chǎn)生耐藥性、安全性評估良好等優(yōu)良特性。并且，桿菌肽在動物保健中具有促進動物生長、提高機體免疫力的作用，是一種在畜牧養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用的飼料添加劑［1］。從分子結(jié)構(gòu)而言，桿菌肽為一類多肽復(fù)合體，包括桿菌肽A、A1、B、C、D、E、F1、F2等多種組分，其中桿菌肽A為主要成分，且生物活性最高［2］。

美國雅來藥廠（2011年已經(jīng)并入美國輝瑞公司）是世界上桿菌肽最大的生產(chǎn)企業(yè)，目前國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)主要有浦城綠康生化有限公司、華北制藥集團華勝公司和天津新星獸藥廠。隨著我國畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，桿菌肽的需求與日俱增，桿菌肽的發(fā)酵生產(chǎn)研究得到廣泛關(guān)注。胡尚勤等［3］通過細胞融合技術(shù)得到一株桿菌肽生產(chǎn)菌，使用檸檬酸為碳源發(fā)酵，桿菌肽產(chǎn)量可以高達985 U/mL。徐加兵等［4］以一株地衣芽孢桿菌（B. licheniformis SIN-669-3）為出發(fā)菌株，經(jīng)過復(fù)合誘變選育和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，桿菌肽產(chǎn)量優(yōu)化前提高14.5%。有報道［5］使用固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)桿菌肽，降低發(fā)酵產(chǎn)物中水分，得到了高濃度桿菌肽產(chǎn)品。目前，關(guān)于桿菌肽的研究報道多集中于菌種誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化方面。而發(fā)酵生產(chǎn)時，菌種是技術(shù)關(guān)鍵。開展菌種篩選工作，可豐富桿菌肽生產(chǎn)菌種資源，有助于桿菌肽的工業(yè)生產(chǎn)，具有重要理論意義和巨大經(jīng)濟效益前景。

本研究首次以低濃度桿菌肽為篩選手段，從自然界中分離桿菌肽抗性菌株，并從中篩選桿菌肽生產(chǎn)菌種，重點選育桿菌肽A組分高產(chǎn)菌株源。對分離得到的優(yōu)良菌株進行發(fā)酵條件初步優(yōu)化，旨在為其工業(yè)開發(fā)利用提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）為本實驗室保存，地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）Y822為本實驗室分離得到。

1.1.2 主要儀器與試劑 722型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；北京創(chuàng)通P3000型高效液相色譜儀；Sigma 3K30型高速離心機；KLUP-UV-10型純水機（成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠）；桿菌肽鋅標(biāo)準品（華北制藥華勝有限公司）；掃描電子顯微鏡（Hitachi SU8010型）。

1.1.3 培養(yǎng)基 藤黃微球菌培養(yǎng)基：牛肉膏0.15%，蛋白胨0.6%，酵母膏0.6%，葡萄糖0.1%，pH7.0。Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH7.0。桿菌肽篩選培養(yǎng)基：將桿菌肽鋅標(biāo)準品使用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解，添加到滅菌后LB固體培養(yǎng)基內(nèi)，使桿菌肽鋅終濃度為10 U/mL，培養(yǎng)基傾倒平板備用。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法 桿菌肽發(fā)酵方法采用徐加兵等［4］描述的培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉2.2%，淀粉0.8%，碳酸鈣0.5%。發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉2.5%；豆粕粉7.0%，硫酸銨0.06%，碳酸鈣0.6%。上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌30 min。種子培養(yǎng)條件為：37℃、150 r/min、pH自然，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃。

1.2.2 桿菌肽含量的測定 以藤黃微球菌為敏感菌株，使用雙碟法［3］測定發(fā)酵液中桿菌肽效價。使用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中桿菌肽A的含量［6］。

1.2.3 桿菌肽產(chǎn)生菌的分離篩選 將果園土樣、活性污泥、畜牧場周邊土樣和泡菜汁等樣品90℃處理15 min，冷卻至室溫，取0.2 mL涂布于桿菌肽篩選培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，挑取在培養(yǎng)基上生長大而飽滿菌落斜面保存。制備藤黃微球菌平板，將篩選得到的菌株接種于藤黃微球菌平板，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑（H）和菌落直徑（C），選取H/C比值大的菌株保存斜面，以備復(fù)篩。然后，將上述篩選得到菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液中桿菌肽含量。

1.2.4 菌種的鑒定 將篩選得到的桿菌肽產(chǎn)生菌進行生理生化鑒定，并對其16S rRNA序列擴增測序，測序結(jié)果比對分析，并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 發(fā)酵條件的初步研究 使用1.2.1描述的桿菌肽種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，分別考察種子培養(yǎng)條件（種齡、接種量）和發(fā)酵培養(yǎng)條件（pH、裝液量）對生產(chǎn)桿菌肽的影響。

2 結(jié)果

2.1 桿菌肽產(chǎn)生菌的分離、篩選及鑒定

經(jīng)平板初篩、藤黃微球菌抑菌試驗和發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩，共篩選到12株桿菌肽產(chǎn)生菌。其中一株產(chǎn)芽孢細菌Y822，不僅具有較高的桿菌肽生產(chǎn)能力，且桿菌肽產(chǎn)物中A組分含量高。因此，選此菌株進行深入研究。菌株Y822在LB 培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣不齊，較薄，表面粗糙，不透明，顯灰白色。顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，該菌呈桿狀，有中生芽孢，菌體長1.5-3.0 μm，寬0.6-0.8 μm。菌株Y822革蘭氏染色呈陽性，其生理生化試驗結(jié)果如表1所示。進而對菌株Y822的16S rRNA進行測序，測序結(jié)果提交GenBank（登錄號HQ005269）。根據(jù)生理生化試驗結(jié)果和16S rRNA測序分析結(jié)果，菌株Y822鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），命名為Bacillus licheniformis Y822，圖1為其掃描電鏡圖。

2.2 種子培養(yǎng)條件對發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的影響

將斜面培養(yǎng)的B. licheniformis Y822接種入液體種子培養(yǎng)基，選擇6個時間點（圖2-A）的種子培養(yǎng)液接種發(fā)酵（接種量5%），考察種子液種齡對發(fā)酵的影響。發(fā)酵培養(yǎng)條件設(shè)定為37℃、pH6.0，500 mL三角瓶裝液量100 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵48 h后測定桿菌肽含量。

表1 菌株Y822的生理生化特征

圖1 B. licheniformis Y822的掃描電鏡圖

圖2-A顯示，種子培養(yǎng)10 h后接種發(fā)酵，得到268.44 U/mL的桿菌肽。隨著種子培養(yǎng)時間的延長，桿菌肽產(chǎn)量不斷提高。當(dāng)種子培養(yǎng)25 h時接種發(fā)酵，可以得到最大桿菌肽產(chǎn)量524.54 U/mL。圖2-B為接種量對發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的影響，此時，種子培養(yǎng)時間固定為25 h，發(fā)酵培養(yǎng)條件同上，發(fā)酵48 h后測定桿菌肽產(chǎn)量。本試驗共考察了6個不同的接種體積（3%-13%），試驗顯示9%接種量為最佳值，發(fā)酵可得到624.55 U/mL桿菌肽。

2.3 發(fā)酵條件對生產(chǎn)桿菌肽的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別調(diào)整為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，培養(yǎng)基滅菌后，接種種子培養(yǎng)液進行桿菌肽發(fā)酵試驗，接種量9%。發(fā)酵液置于500 mL三角瓶裝中，裝液量100 mL，37℃恒溫震蕩（200 r/min）培養(yǎng)48 h后測定桿菌肽產(chǎn)量。如圖3-A所示，培養(yǎng)基初始pH為6.0時，得到桿菌肽620.56 U/mL。當(dāng)pH值由6.0上升至7.0時，桿菌肽產(chǎn)量逐漸上升。發(fā)酵液中桿菌肽濃度在培養(yǎng)基初始pH7.0時達到最大值（712.36 U/mL）。發(fā)酵培養(yǎng)基pH高于7.0后，桿菌肽產(chǎn)量反而呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)果表明，中性環(huán)境更適宜菌株B. licheniformis Y822積累桿菌肽。

圖2 培養(yǎng)條件對B. licheniformis Y822生產(chǎn)桿菌肽的影響

進一步考察通氣量對發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的影響。搖床震蕩培養(yǎng)時，在相同轉(zhuǎn)速下裝液量的大小直接關(guān)系到發(fā)酵時的通氣量。本研究在500 mL三角瓶中分別裝入40、60、80、100和120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定桿菌肽產(chǎn)量，結(jié)果（圖3-B）顯示，當(dāng)培養(yǎng)基裝液量為40 mL時，B. licheniformis Y822發(fā)酵得到的桿菌肽濃度最高（779.54 U/mL）。

圖3 發(fā)酵條件對B. licheniformis Y822生產(chǎn)桿菌肽的影響

2.4 發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽穩(wěn)定性試驗

將斜面培養(yǎng)的B. licheniformis Y822菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)，共傳5代。將每一傳代得到的菌株進行桿菌肽發(fā)酵試驗，以驗證菌株的發(fā)酵產(chǎn)量和穩(wěn)定性。結(jié)果（表2）顯示，B. licheniformis Y822傳代5次的平均產(chǎn)量為（783.51±7.34）U/mL，其中桿菌肽A占（75.04±0.83）%。

表2 B. licheniformis Y822發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的穩(wěn)定性試驗

3 討論

從自然界樣品中分離篩選菌種時，選擇合適的篩選方式十分重要。有研究報道［7，8］，桿菌肽在細胞內(nèi)合成后，需要通過位于細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白將其分泌到胞外。如果胞外桿菌肽濃度超過一定限度，位于細胞膜上的信號蛋白會阻止桿菌肽合成，從而避免桿菌肽產(chǎn)生自身毒害。一般而言，對桿菌肽耐受能力越強的菌株，其自身越有可能具備強大的桿菌肽合成能力。

桿菌肽生產(chǎn)菌株大多分布于芽孢桿菌屬［3］，本研究對樣品90℃處理15 min，目的是為了殺死樣品中雜菌（不產(chǎn)芽孢細菌和霉菌）。隨后，以低濃度桿菌肽為篩選手段進一步優(yōu)選桿菌肽生產(chǎn)菌株。本試驗共篩選得到了12株桿菌肽產(chǎn)生菌，經(jīng)過初步鑒定，分別屬于地衣芽孢桿菌（Bacillus licheninformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。其中，分離并鑒定得到的B. licheniformis Y822生長速度快，對指示菌（藤黃微球菌）抑菌效果最佳，因此主要對其進行深入研究。

發(fā)酵前進行種子培養(yǎng)可以達到活化菌種、獲得高濃度細胞的目的。并且，種子培養(yǎng)還可誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生適用于發(fā)酵生產(chǎn)的多種酶類，可提高后續(xù)發(fā)酵效率。試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種培養(yǎng)10 h后，種子培養(yǎng)基開始出現(xiàn)明顯液化，即黃豆餅粉和淀粉被酶解利用。因此，從10 h開始考察種子培養(yǎng)基培養(yǎng)時間對發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的影響。種子液培養(yǎng)時間低于25 h時，菌體雖然開始產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶液化培養(yǎng)基，但是還僅限于細胞增殖，與桿菌肽合成相關(guān)酶系沒有得到誘導(dǎo)表達。此時接種發(fā)酵，會導(dǎo)致菌體利用發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源大量增殖，導(dǎo)致后期合成桿菌肽時營養(yǎng)不足。種子液培養(yǎng)25 h時，菌體正處于對數(shù)生長末期，此時菌體已經(jīng)開始合成桿菌肽。接種發(fā)酵后，菌體利用發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)合成桿菌肽，達到了最高產(chǎn)量。種子培養(yǎng)超過25 h后，由于種子培養(yǎng)基中營養(yǎng)匱乏和桿菌肽積累，微生物鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體開始產(chǎn)生芽孢，不利于繼續(xù)接種發(fā)酵培養(yǎng)基。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過程中，發(fā)酵接種量一般控制在5%-10%之間。接種量過低，發(fā)酵培養(yǎng)時沒有足夠的菌體細胞，會導(dǎo)致延滯期過長，降低發(fā)酵產(chǎn)率。接種量過高會導(dǎo)致引入發(fā)酵培養(yǎng)基的細胞過多，過度消耗培養(yǎng)基中營養(yǎng)，不利于發(fā)酵產(chǎn)物積累。本研究中，過高的接種量還會導(dǎo)致B. licheniformis Y822在種子培養(yǎng)液中積累的桿菌肽引入發(fā)酵培養(yǎng)基中，不利于后續(xù)發(fā)酵過程，因此最佳接種量為9%。

培養(yǎng)條件是發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素，本研究考察培養(yǎng)基pH和通氣量（裝液量）對發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的影響。研究顯示，B. licheniformis Y822在中性條件下生產(chǎn)桿菌肽能力最強。雷波［9］研究了pH對B. licheniformis的影響，結(jié)果顯示7.0和7.4是菌體最佳生長pH和最優(yōu)抑菌條件，其結(jié)果與本研究相一致。本研究中，菌株B. licheniformis Y822發(fā)酵產(chǎn)生的桿菌肽濃度與通氣量密切相關(guān)。鄧坤等［10］詳細研究了利用地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽時，培養(yǎng)基中溶氧對產(chǎn)物積累的影響。其研究表明，發(fā)酵液中溶氧提高，會顯著提高菌體活力，強化菌體的糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝。并且，高溶氧還會提高培養(yǎng)基中溶解氨基酸濃度，有利于合成桿菌肽［11］。

從自然界篩選得到菌株在多次傳代培養(yǎng)過程中容易產(chǎn)生遺傳性狀退化，影響其工業(yè)化應(yīng)用價值。本研究將B. licheniformis Y822傳代5次，菌種生產(chǎn)桿菌肽的能力未發(fā)現(xiàn)明顯衰減，并且桿菌肽A含量始終保持在75%左右。桿菌肽是一類多肽混合物，其中A組分含量決定著其生物活性高低，篩選高產(chǎn)桿菌肽A組分的菌種更具應(yīng)用價值［12］。本研究分離篩選得到桿菌肽生產(chǎn)菌（B. licheniformis Y822），菌株遺傳性好，產(chǎn)量穩(wěn)定，并且產(chǎn)物中A組分含量高，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。如果進一步對該菌進行深入研究（如優(yōu)化培養(yǎng)基組分，使用發(fā)酵罐培養(yǎng)以提高溶解氧等），相信B. licheniformis Y822會有更好的發(fā)酵表現(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究利用桿菌肽生產(chǎn)菌具備抗自身代謝產(chǎn)物抑制特點，使用低濃度桿菌肽為篩選手段，成功分離得到桿菌肽產(chǎn)生菌B. licheniformis Y822。B. licheniformis Y822發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽能力穩(wěn)定，可得到生產(chǎn)（783.51±7.34）U/mL桿菌肽，其中桿菌肽A占（75.04±0.83）%。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation，Identification and Fermentation Characterization of a Bacitracin Producing Bacteria

Zhang Yuming1Ni Zhihua1Li Baoku2
（1. College of Life Science，Hebei University，Baoding071002；2. College of Pharmaceutical Science，Hebei University，Baoding071002）

Bacitracin has been widely utilized in livestock breeding and cultivation， and it is necessary to screen strains for improving bacitracin production. In this study， low concentration of bacitracin was used to screen bacitracin producer， and one strain was isolated and identified as Bacillus licheninformis strain Y822. The optimal culture condition for the strain was pH7.0， and the improvement of oxygen supply was favorable to the production of bacitracin. B. licheninformis Y822 was sub-cultured for 5 generations. Each generation of the strain was used to produce bacitracin using the optimized fermentation condition. The average value of the produced bacitracin from 5 generations of B. licheninformis Y822 was （783.51±7.34）U/mL， and the percentage of bacitracin A was about（75.04±0.83）%. The production of bacitracin by B. licheniformis Y822 was stable and efficient. Therefore， B. licheniformis Y822 was a potential candidate for producing bacitracin in industry.

Bacillus licheninformis；bacitracin；isolation；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.024

2014-09-19

河北省教育廳計劃（z2012206），保定市科技局計劃（12ZN012）

張玉明，博士，講師，研究方向：發(fā)酵工程、生物化工；E-mail：zhangyuming@hbu.edu.cn