郭雙雙 史冊(cè) 韓梅 楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院　吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春　130118）

FX-139發(fā)酵液及菌絲體提取物對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)及防御酶系的影響

郭雙雙 史冊(cè) 韓梅 楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130118）

以人參栽培土壤中分離純化的生防菌株放線菌FX-139的發(fā)酵液和菌絲體提取物為供體，研究了其對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響，及誘導(dǎo)受體防御酶的能力。結(jié)果表明：（1）FX-139發(fā)酵液和菌絲體提取物濃度為20 mg/L的處理?xiàng)l件對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)，比對(duì)照增加了68.96%、51.60%，差異顯著。（2）發(fā)酵液水飽和正丁醇提取物處理下PAL、POD、PPO酶活峰值分別出現(xiàn)在第21天、第14天、第28天，比CK依次提高了1.29倍、2.5倍、2.12倍。菌絲體丙酮提取物處理下PAL、POD、PPO酶活峰值分別出現(xiàn)在第21天、第14天、第14天，比CK依次提高了1.9倍、2.6倍、1.4倍。（3）通過(guò)對(duì)人參愈傷組織防御酶活性研究表明，發(fā)酵液和菌絲體提取物處理下PAL、POD、PPO酶活性均有明顯變化?？傮w來(lái)說(shuō)，放線菌FX-139發(fā)酵液和菌絲體提取物可以誘導(dǎo)人參愈傷組織防御反應(yīng)的表達(dá)，發(fā)酵液提取物對(duì)POD、PPO有良好的誘導(dǎo)作用，菌絲體提取物對(duì)PAL、POD和PPO均有較好的誘導(dǎo)效果。

放線菌；人參愈傷組織；PAL；POD；PPO

誘導(dǎo)抗病性是植物抗病防御反應(yīng)的一種重要表現(xiàn)形式，具有非特異性［1，2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一些生防微生物可以作為誘導(dǎo)因子，促使植物體內(nèi)防御酶活性發(fā)生變化，從而提高自身的免疫力，增強(qiáng)抗病性，最終使植物獲得抵御病害的能力。因此，防御酶被認(rèn)為是植物抗病機(jī)制的關(guān)鍵之一［3，4］，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)大量合成一系列重要的防御酶，主要包括苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL），過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD），多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）等。

在植物抗病反應(yīng)中，PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，它能催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸，可促進(jìn)產(chǎn)生植保素類物質(zhì)，如類黃酮、木質(zhì)素和水楊酸（Salicylic acid，SA）（植物抗病反應(yīng)的重要信號(hào)分子）的形成，所以PAL酶活性可作為植物抗逆境能力的一個(gè)生理指標(biāo)［5］。一般研究認(rèn)為其活性升高，植物抗病性增強(qiáng)，活性降低，抗病性減弱［6］。POD是植物抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵性酶，是植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，能水解多余的細(xì)胞毒性物質(zhì)H2O2和OH-，同時(shí)POD也是木質(zhì)素生物合成中最后一步的關(guān)鍵酶［7］，木質(zhì)素具有限制病原菌酶和毒素向寄主擴(kuò)散、控制水和營(yíng)養(yǎng)物由寄主向病原菌擴(kuò)散、抑制病原菌生長(zhǎng)和增殖的作用。PPO可以把酚類物質(zhì)氧化為相應(yīng)的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)對(duì)病原微生物起著抑制作用或殺傷作用，具有一定的抗病能力［8］。PPO同時(shí)還參與木質(zhì)素的合成，使細(xì)胞壁增厚來(lái)抵御病菌的侵入和擴(kuò)展，從而抑制發(fā)病。

放線菌FX-139為本實(shí)驗(yàn)從吉林省撫松縣萬(wàn)良鎮(zhèn)人參栽培基地土壤分離得到，為酒紅土褐鏈霉菌（Streptomyces vinaceus-drappus），濾紙片法顯示其對(duì)7種人參病原菌具有良好的拮抗性。此外，還發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液的正丁醇提取物和菌絲體丙酮提取物對(duì)人參常見(jiàn)病病原菌均有抑制作用（結(jié)果另文報(bào)道）。但對(duì)人參植株的生長(zhǎng)狀況和是否可以作為誘導(dǎo)因子，引起植物體內(nèi)防御酶發(fā)生變化，提高植物的抗病性的研究并不明確。本研究以此為切入點(diǎn)，研究放線菌FX-139對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)量和相關(guān)防御酶活性變化的影響，旨在初步探討FX-139的抗性誘導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌 放線菌FX-139為酒紅土褐鏈霉菌（Streptomyces vinaceus-drappus）由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)分離、保存。

1.1.2 人參愈傷組織 人參愈傷組織由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院植物生態(tài)學(xué)與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 高氏一號(hào)培養(yǎng)基；ISP2液體培養(yǎng)基；改良MS培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 FX-139發(fā)酵液提取物的收集 FX-139在高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化后，將菌餅接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，28℃下在搖床中培養(yǎng)48 h（180 r/min），得到種子液。種子液以10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次發(fā)酵，振蕩培養(yǎng)7 d后，在10 000 r/min下離心20 min后取上清。上清液以水飽和正丁醇反復(fù)萃取3次，比例為1∶1，收集萃取液，減壓濃縮至浸膏，計(jì)算得率后，放入4℃冰箱中備用。

1.2.2 FX-139菌絲體提取物的收集 將1.2.1離心得到的菌絲體以2倍體積的80%丙酮浸泡，超聲破碎（70 Hz，35℃，30 min）。重復(fù)3次后收集丙酮提取液，減壓濃縮至浸膏，即得菌絲體提取液，計(jì)算得率后，放入4℃冰箱中備用。

1.2.3 供試培養(yǎng)基的制備 將1.2.1和1.2.2中收集到的發(fā)酵液提取物及菌絲體提取物配制成1 g/L的母液，無(wú)菌條件下微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾除菌，將無(wú)菌濾液加入MS培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基的終濃度分別為10、20、50、100、200 及500 mg/L，對(duì)照為蒸餾水，待培養(yǎng)基凝固即得供試培養(yǎng)基。

1.2.4 愈傷組織生長(zhǎng)情況測(cè)定 先稱取制備好的空培養(yǎng)基重量，然后在無(wú)菌條件下接入愈傷組織后稱取總重量，接種后總重量與空培養(yǎng)基重量之差即為接種量，控制每瓶接種量盡量一致，每個(gè)處理3次重復(fù)。接種后置于21℃的培養(yǎng)箱中，暗環(huán)境下培養(yǎng)28 d，然后取出愈傷組織稱量其重量，得出愈傷組織生長(zhǎng)量，愈傷組織增長(zhǎng)量=收獲量-接種量；愈傷組織增長(zhǎng)率（%）=愈傷組織增長(zhǎng)量/接種量×100%［9］。

1.2.5 愈傷組織防御酶的測(cè)定 直接在無(wú)菌條件下接種人參愈傷組織，置于培養(yǎng)箱中在21℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)28 d。其中，每隔7 d從培養(yǎng)瓶中取出適量的愈傷組織，液氮迅速冷卻，置于-80℃的超低溫冰箱中，用于愈傷組織的酶活性測(cè)定。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測(cè)定：參考文獻(xiàn)［10，11］，過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定：采用愈創(chuàng)木酚法［10］，多酚氧化酶（PPO）活性的測(cè)定：采用紫外分光光度法［12］。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 用 DPSv7.05對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Williamson的方法評(píng)價(jià)FX-139發(fā)酵液提取物和菌絲體提取物對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量的影響［13］，即：RI=（T1/T0-1）。其中，RI為發(fā)酵液提取物和菌絲體提取物對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量的效應(yīng)指數(shù)，T1為兩種提取物處理下人參愈傷組織的生長(zhǎng)量，T0為對(duì)照人參愈傷組織的生長(zhǎng)量。當(dāng)RI＞ 0為促進(jìn)，RI＜ 0為抑制，絕對(duì)值的大小與作用強(qiáng)度成正比［14］。

2 結(jié)果

2.1 FX-139發(fā)酵液提取物和菌絲體提取物對(duì)愈傷

組織生長(zhǎng)量的影響

由表1可見(jiàn)，F(xiàn)X-139發(fā)酵液提取物和菌絲體提取物對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量的影響程度與濃度密切相關(guān)，呈典型的“低促高抑”的濃度效應(yīng)。兩者對(duì)人參愈傷組織增長(zhǎng)促進(jìn)作用最大的均為20 mg/L的處理，分別增加68.96%（發(fā)酵液）、51.60%（菌絲體），與CK差異顯著。其次，隨處理濃度不斷增加，抑制作用不斷增強(qiáng)，與CK相比，發(fā)酵液50-500 mg/L處理下開(kāi)始對(duì)受體具有顯著的抑制作用，抑制率分別為18.1%、19.2%、28.1%和47.9%，平均抑制率為28.3%，化感效應(yīng)值分別為-0.192、-0.53、-0.281、-0.479；平均化感效應(yīng)為-0.283。菌絲體提取物從100 mg/L開(kāi)始對(duì)愈傷的生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制作用，抑制率為28.06%。100-500 mg/L處理下抑制率分別為9.7%，25.2%和32.3%，平均抑制率為22.4%，化感效應(yīng)值分別為-0.097、-0.252、-0.323；平均化感效應(yīng)為-0.224。

表1 FX-139發(fā)酵液和菌絲體提取物對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)量的影響

2.2 發(fā)酵液及菌絲體提取物對(duì)人參愈傷組織防御酶系誘導(dǎo)抗性的影響

2.2.1 FX-139發(fā)酵液提取物對(duì)人愈傷組織防御酶系的誘導(dǎo)抗性影響 發(fā)酵液提取物處理下人參愈傷組織PAL酶活性變化，如圖1-A所示。CK處理下PAL總體看來(lái)活性變化在7-14 d略有下降，14 d后酶活性變化平穩(wěn)，表明接種7 d后愈傷組織逐漸適應(yīng)了繼代培養(yǎng)基，逐漸趨于穩(wěn)定生長(zhǎng)。10-50 mg/L濃度范圍內(nèi)，酶活性變化趨勢(shì)與CK一致但始終低于CK，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性逐漸降低；100-500 mg/L處理下酶活性變化呈“單峰型”。各濃度處理下在14 d后PAL酶活值均低于CK，平均降低了24.81%。100-500 mg/L處理在培養(yǎng)21-28 d時(shí)出現(xiàn)活性增大的情況，其中500 mg/L處理與CK差異顯著，比CK提高了1.29倍。表明發(fā)酵液100-500 mg/L處理可促使人參愈傷組織PAL酶活性增強(qiáng)。

發(fā)酵液提取物處理下人參愈傷組織POD酶活性變化，如圖1-B所示。培養(yǎng)周期內(nèi)，CK處理下POD活性較穩(wěn)定，主要在28.4-41.2 U/mg范圍內(nèi)變化，21 d有微弱增加，10 mg/L處理下在愈傷組織整個(gè)生長(zhǎng)周期均與CK保持一致。在愈傷組織生長(zhǎng)前期，20-100 mg/L處理下酶活性的變化趨勢(shì)與CK一致，但隨著處理濃度增加，第21天20-100 mg/L處理下活性大幅度提高，達(dá)到活性峰值，最大值比CK提高1.60倍，差異顯著，而隨濃度的增加，處理200-500 mg/L活性高峰提前至第14天出現(xiàn)，最大值比CK提高2.50倍，差異顯著。由此可見(jiàn)，發(fā)酵液可顯著影響POD酶的活性，提高其活力或改變其變化趨勢(shì)。

發(fā)酵液提取物處理下人參愈傷組織PPO活性變化，如圖1-C所示。各濃度處理下PPO酶活性變化為“單峰型”。CK最高值出現(xiàn)在21 d，總體看來(lái)活性變化平穩(wěn)。接種愈傷7 d后10-100 mg/L處理下酶活性低于CK，平均降低了15.63%。200-500 mg/L處理下均高于CK。第14天 200-500 mg/L處理下酶活性下降，但始終高于CK，10-100 mg/L處理下酶活性卻提高來(lái)完成對(duì)愈傷組織的保護(hù)作用，其中100 mg/L處理下酶活性變化較為明顯，酶活性為CK的2.12倍，差異顯著。14 d后各處理下酶活性均高于CK，表現(xiàn)為隨著時(shí)間和濃度的升高，酶活性提高，愈傷組織誘導(dǎo)抗性增強(qiáng)，10-100 mg/L處理下酶活性達(dá)到峰值，最大值為CK的1.66倍，但21 d后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性逐漸下降，但始終高于CK。而濃度為200-500 mg/L處理下酶活性依然呈上升趨勢(shì)，第28天達(dá)到峰值，最大值為CK的2.05倍。表現(xiàn)為高濃度處理可以延長(zhǎng)PPO活性表達(dá)的時(shí)間。

圖1 FX-139 發(fā)酵液提取物對(duì)防御酶活性的影響

2.2.2 FX-139菌絲體提取物對(duì)人愈傷組織防御酶系的誘導(dǎo)抗性影響 菌絲體提取物處理下人參愈傷組織PAL活性變化，如圖2-A所示。各濃度處理下PAL活性變化為“單峰型”，200-500 mg/L處理下酶活性與CK變化趨勢(shì)始終一致。接種愈傷7 d后菌絲體提取物各濃度處理下的酶活性均高于CK，最大值為CK的1.27倍。7-14 d在200-500 mg/L處理下PAL活性都有不同程度的下降，但始終高于CK，最大值為CK的1.90倍。第21天各處理?xiàng)l件下酶活性均達(dá)到峰值，最大值為CK的1.69倍，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)21 d后各處理?xiàng)l件下酶活性均有不同程度的下降，但始終高于CK。

菌絲體提取物處理下人參愈傷組織POD活性變化，如圖2-B所示。各濃度處理下PAL活性變化為“單峰型”。接種愈傷7 d后各處理下酶活性均高于CK。14 d時(shí)除10-20 mg/L處理外所有處理酶活性均提高，達(dá)到峰值，其中以100 mg/L處理最為明顯，最大值為CK的2.60倍。10-20 mg/L處理下在第21天達(dá)到峰值，最大值為CK的1.70倍。21 d后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，POD活性均有不同程度的下降。綜上所述，隨濃度的增加，POD的活性高峰期提前。由14 d提前到7 d，20-500 mg/L對(duì)人參愈傷組織POD有良好的誘導(dǎo)作用。

菌絲體提取物處理下人參愈傷組織PPO活性變化，如圖2-C所示。各濃度處理下PAL活性變化為“單峰型”。CK處理下PPO總體看來(lái)活性變化平穩(wěn)。接種7 d后各濃度處理下PPO活性均接近CK。接種14 d后10-100 mg/L處理下PPO活性均有不同程度下降，但始終高于CK，最大值為CK的1.15倍，濃度200-500 mg/L處理下酶活性到達(dá)峰值，最大值為CK的1.40倍，接種14-28 d后各濃度處理下酶活性依然升高，10-100 mg/L處理下酶活性直線上升，與28 d到達(dá)活性高峰，最大值為CK的1.32倍。綜上所述，20-100 mg/L處理下酶活性平均為CK的1.25倍，誘導(dǎo)效果好于200-500 mg/L的處理。由此也可以看出，在菌絲體誘導(dǎo)抗性的過(guò)程中PPO響應(yīng)滯后，在人參愈傷組織生長(zhǎng)末期提高來(lái)保護(hù)愈傷組織。

圖2 FX-139菌絲體提取物對(duì)防御酶活性的影響

3 討論

在研究發(fā)酵液提取物和菌絲體提取物對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量的影響過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，相同濃度下發(fā)酵液的促進(jìn)或抑制活性均強(qiáng)于菌絲體，推測(cè)可能與微生物釋放到培養(yǎng)液中的代謝物質(zhì)的積累有關(guān)。

放線菌FX-139不同濃度發(fā)酵液和菌絲體提取物處理人參愈傷組織后，愈傷組織中防御酶PAL、PPO和POD的活性均發(fā)生明顯變化。在發(fā)酵液提取物誘導(dǎo)抗性的過(guò)程中，PAL、PPO、POD由于濃度不同導(dǎo)致變化趨勢(shì)各不相同，發(fā)酵液對(duì)PAL的影響主要表現(xiàn)為低濃度抑制，高濃度促進(jìn)，PAL在濃度100-500 mg/L處理下在第21天活性達(dá)到高峰，而POD各個(gè)濃度處理下酶活性均高于CK，且差異顯著。POD是防御酶清除活性氧系統(tǒng)的第一道防線，植物遭遇病原菌入侵后POD首先發(fā)揮作用。隋麗等［15］將放線菌769發(fā)酵液處理水稻植株葉片，研究主要防御酶活性變化，發(fā)現(xiàn)769菌株發(fā)酵液提高過(guò)氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。以發(fā)酵液原液的作用效果最為顯著，本研究與上述報(bào)道基本相符。

在菌絲體提取物誘導(dǎo)的抗性過(guò)程中，PAL在各濃度處理下活性均高于CK，且差異顯著，其中以20 mg/mL在第21天誘導(dǎo)能力最大，此濃度對(duì)人參愈傷組織的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。POD在接種愈傷組織7 d后各處理下酶活性均高于CK，其中濃度為20 mg/L處理下第21天酶活性達(dá)到峰值。說(shuō)明菌絲體提取物對(duì)PAL、POD均有良好的誘導(dǎo)抗性作用。而在發(fā)酵液和菌絲體兩種處理下PPO活性均有不同程度提高，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這與王婧等［16］使用放線菌的發(fā)酵液灌根后測(cè)定白菜植株體內(nèi)防御酶系的變化結(jié)果基本吻合。

本研究中PAL、PPO 和 POD受發(fā)酵液和菌絲體提取物誘導(dǎo)的影響各不相同，主要是在對(duì)這3種防御酶表達(dá)時(shí)間和活性的提高存在差異，這可能是FX-139發(fā)酵液和菌絲體提取物對(duì)人參愈傷組織生理生化代謝的影響不同所致。FX-139發(fā)酵液和菌絲體提取物不僅對(duì)人參常見(jiàn)病病原菌有明顯的抑制作用，還可通過(guò)誘導(dǎo)人參愈傷組織防御酶活性的變化而增強(qiáng)人參植株的抗病性。這表明放線菌FX-139所產(chǎn)生的活性物質(zhì)在具有抑菌作用的同時(shí)還具有廣譜的誘導(dǎo)抗性，具體何種成分起關(guān)鍵作用還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以人參土壤中分離純化的生防菌株放線菌FX-139的發(fā)酵液和菌絲體提取物為供體，研究了其對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響，以及誘導(dǎo)受體抗逆酶活性的能力。低濃度的發(fā)酵液和菌絲體提取物對(duì)人參愈傷組織的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，以20 mg/L的處理最好。發(fā)酵液提取物不同濃度處理下既提高了防御酶POD、PPO的活性，同時(shí)也保證了愈傷組織正常生長(zhǎng)，說(shuō)明發(fā)酵液提取物對(duì)POD、PPO有良好的誘導(dǎo)抗性作用。菌絲體提取物對(duì)PAL、POD和PPO均有良好的誘導(dǎo)抗性作用。

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（責(zé)任編輯李楠）

The Effect of the Fermented Liquid and Mycelium Extract of FX-139 on the Growth and Defense Enzymes of Ginseng callus

Guo Shuangshuang Shi Ce Han Mei Yang Limin
（College of Herbal Medicine，Jilin Agricultural University，State Key Laboratory for Ecological Restoratipn and Ecosystem Management of JLPMOST Collective Construct-KLUER，Changchun130118）

Using the fermented liquid and mycelium extract of actinomycetes FX-139 isolated from ginseng rhizosphere as the donor，the effects of it on the growth and ability of inducing defense enzyme activity of ginseng callus were studied. The results showed that: （1）The treatment of FX-139 fermented liquid and mycelium extract at the concentration of 20 mg/L had the strongest promoting effect on Ginseng callus growth， increasing 68.96% and 51.60% higher than that in the control， i.e.， there was significant difference. （2）There was an active peak of PAL， POD and PPO in 21 d， 14 d and 28 d respectively under the treatment with water saturation n-butyl alcohol extract of fermented liquid， it raised 1.29 times， 2.5 times， and 2.12 times against the control group respectively. There was an active peak of PAL， POD and PPO in 21 d， 14 d and 14 d respectively under the treatment with acetone extract of mycelium， it raised 1.9 times， 2.6 times， and 1.4 times against the control group respectively. （3）The change of defense enzyme activities in ginseng callus was detected. PAL， POD and PPO enzyme activity were obviously changed with the treatment of fermented liquid and mycelium extract. Overall， Ginseng callus defense responses could be induced by fermented liquid and mycelium extract of FX-139. Fermented liquid extract could effectively induced POD and PPO， and mycelium extract could effectively induced PAL， POD and PPO.

actinomycetes；Ginseng callus；PAL；POD；PPO

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.020

2014-08-27

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI03B01-02），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270371），吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（20125068）

郭雙雙，男，碩士生研究生，研究方向：微生物及分子生物學(xué)；E-mail：1530811226@qq.com

楊利民，男，博士，教授，研究方向：中藥資源生態(tài)與藥材質(zhì)量調(diào)控；E-mail：ylmh777@126.com