岳光振 金曼 李俊林 楊順瑛 郭滿園 蘇彥華

（中國科學(xué)院南京土壤研究所 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京　210008）

沙冬青脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的克隆及表達(dá)分析

岳光振 金曼 李俊林 楊順瑛 郭滿園 蘇彥華

（中國科學(xué)院南京土壤研究所 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008）

通過RACE技術(shù)從沙冬青中克隆獲得了脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AmProT（GenBank登錄號(hào)為KJ873133）。序列分析表明，AmProT基因開放閱讀框?yàn)? 329 bp，編碼442個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為48.07 kD，等電點(diǎn)為9.32，含有11個(gè)跨膜區(qū)域，具有典型的脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征。進(jìn)化分析顯示，AmProT與大豆ProT的相似性達(dá)到86%。熒光定量PCR分析表明，AmProT在地上部的表達(dá)量要顯著高于地下部，在受到干旱、高鹽、脫落酸脅迫后表達(dá)量呈上調(diào)趨勢，推測AmProT可能在沙冬青響應(yīng)干旱、鹽等非生物脅迫過程中發(fā)揮作用。

沙冬青；脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因；基因克??；表達(dá)分析

常綠闊葉灌木蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus），作為古老的第三季殘遺物種［1］，主要分布在我國的內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅等省區(qū)［2，3］，其適應(yīng)性很強(qiáng)，不僅抗寒而且耐旱，在年降水量低于240 mm、蒸發(fā)量2 000-3 000 mm、極端低溫-24.8℃、極端高溫37.7℃的惡劣環(huán)境下，仍能正常生長［4］。鑒于在這種極端脅迫條件下的生存能力，使得沙冬青成為一種研究荒漠植物抗逆性的理想材料。

在植物生長受到的諸多環(huán)境脅迫中，滲透脅迫是其中最為嚴(yán)重的制約因素之一［5，6］。植物適應(yīng)滲透脅迫是一種復(fù)雜的生理現(xiàn)象。植物通過體內(nèi)積累可溶性滲透物質(zhì)，保證正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以應(yīng)對(duì)滲透脅迫［7］。在這些可溶性物質(zhì)中，脯氨酸是分布最廣的滲透劑［8］。在受到滲透脅迫時(shí)，脯氨酸作為一個(gè)滲透調(diào)節(jié)劑持續(xù)在植物體內(nèi)積累［9］，使細(xì)胞保持適當(dāng)?shù)臐B透勢，穩(wěn)定并保護(hù)生物大分子結(jié)構(gòu)以及功能［10］。

脯氨酸在植物體內(nèi)不是均一存在的，在一些不含葉綠體的組織中，脯氨酸的積累主要靠外源脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)［11］。自從1996年Rentsch等［12］利用酵母SHR缺陷突變體與擬南芥cDNA文庫克隆出第一個(gè)編碼脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因（ProT2）以來，已經(jīng)有水稻（Oryza sativa）［13］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、榆錢菠菜（Atriplex hortensis）［14］、大麥（Hordeum vulgare）［15］等的ProT基因被成功克隆。研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)具有物種差異性。Udea等［16］發(fā)現(xiàn)，大麥HvProt基因主要在根部表達(dá)，在受到鹽脅迫的情況下表達(dá)更為強(qiáng)烈；Igarashi［13］和Silke等［17］發(fā)現(xiàn)水稻的OsProT基因和擬南芥AtProT3基因主要在植株地上部表達(dá)。

目前，關(guān)于沙冬青基因克隆與遺傳表達(dá)方面的研究，Wei等［18］發(fā)現(xiàn)AmNHX2基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥受到干旱和鹽脅迫時(shí)表達(dá)量增加；Liu等［19］克隆獲得AmLEA，異位表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因提高了大腸桿菌對(duì)冷和熱的適應(yīng)能力；Song等［20］發(fā)現(xiàn)AmGS提高了轉(zhuǎn)基因石楠樹的御寒能力。另外，Zhou［21］、Pang［22］和Wu［23］等分別對(duì)沙冬青進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，分析研究了沙冬青在干旱和冷脅迫下部分基因的表達(dá)狀況。

脯氨酸在沙冬青適應(yīng)脅迫過程中發(fā)揮著重要作用［24，25］，目前還沒有關(guān)于沙冬青脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因克隆與表達(dá)方面的報(bào)道。本研究通過RACE技術(shù)，克隆了沙冬青脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因，命名為AmProT（登錄號(hào)KJ873133），利用生物信息學(xué)方法對(duì)其核苷酸序列以及編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)該基因的組織表達(dá)模式以及脅迫調(diào)控表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨為進(jìn)一步研究其在抗逆過程中的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）種子由甘肅民勤沙生植物園提供。

1.1.1 沙冬青育苗 挑取大小一致、籽粒飽滿的沙冬青種子，洗凈后用70%的乙醇浸泡30 s，用無菌水清洗4-5次，清水浸泡24 h，種子吸脹。然后轉(zhuǎn)移到鋪有雙層吸水紙的滅菌培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加適量蒸餾水，置于25℃的暗光培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。3 d之后，將長勢一致的發(fā)芽沙冬青轉(zhuǎn)移到有孔的，內(nèi)徑為17.5 cm×9 cm×3.5 cm的長方體塑料盒中，每盒定植72棵沙冬青，用改良的pH5.8的1/2Hoagland［大量元素Ca（NO3）2·4H2O，945 mg/L；NaNO3，425 mg/L；NH4NO3，80 mg/L；NaH2PO4，121 mg/L；MgSO4·7H2O，493 mg/L；微量元素H3BO3，2.86 mg/L；MnSO4·4H2O，1.61 mg/L；CuSO4·7H2O，0.07 mg/L；ZnSO4·7H2O，0.22 mg/L；Na2MnO4·2H2O，0.12 mg/L；鐵鹽FeSO4·7H2O，5.57 g/L；Na2EDTA·2H2O，7.45 g/L］營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d更換一次新營養(yǎng)液。

1.1.2 處理及取樣 培養(yǎng)3周之后，選取生長一致的四葉一心期沙冬青幼苗進(jìn)行3種脅迫處理：18%（W/V）的PEG-6000（-0.4 MPa），100 mmol/L的Na-Cl，100 μmol/L的脫落酸（ABA）。樣品在處理1、3、6、12、24、48 h時(shí)，分別從地上部和地下部取樣，對(duì)照為處理0 h的樣品。上述樣品均用液氮速凍，存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 稱取0.1 g沙冬青樣品，用RNAiso Plus植物RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）提取總RNA。取RNA 2 μg，根據(jù)Primescript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Invirtrogen）試劑盒的說明，以O(shè)ligo-dT為引物通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈。用于cDNA全長的克隆和定量分析。

1.2.2 全長cDNA序列克隆 用DNAMAN軟件比對(duì)NCBI上登錄的豇豆（Vigna unguiculata）（AB3775-28）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（NM_129215）、番茄（Solanum lycopersicum）（NM_001247065）和苜蓿（Medicago truncatula）（XM_003616498）等植物的ProT基因序列。設(shè)計(jì)保守區(qū)引物P1（5'-YAVYGCGATTCATGGTTTC-A-3'）/P2（5'-AATYAYAMRTCHGCAAAAACA-3'）；根據(jù)保守區(qū)片段測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物P3（5'-CCATTTTTCCTGATTATCTTT-3'）/P4（5'-TGGCACTGGTTC-AACATTGGTTT-3'）用于3'-RACE克隆，P5（5'-ATGATGTAGCCAGTATTTATC-3'）/P6（5'-TGTTGACT-CCGGTAGTGAGG-3'）用于5'-RACE克隆，根據(jù)保守區(qū)，3'-RACE和5'-RACE三段cDNA序列的拼接結(jié)果，設(shè)計(jì)引物P5/P6于用基因全長擴(kuò)增。3'-RACE和5'-RACE反 應(yīng) 按SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual（Clontech）試劑盒說明書進(jìn)行。各輪PCR產(chǎn)物均用膠回收試劑盒純化后與pMD19-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落，PCR鑒定后由華大公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過DNAMAN6.0將沙冬青ProT基因cDNA全長序列翻譯成氨基酸序列；利用ProtParam分析其編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；通過NCBI中的Conserved Domains分析其功能結(jié)構(gòu)域；用SignalP4.1軟件預(yù)測信號(hào)肽；用TMpred軟件預(yù)測可能存在的跨膜區(qū)；利用Psort預(yù)測亞細(xì)胞定位；利用Sopma進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

利用NCBI的Blast程序進(jìn)行AmProT基因編碼氨基酸序列的一致性對(duì)比，采用Mega5.0軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 以培養(yǎng)3周之后的沙冬青為材料，18%（W/V）的PEG-6000，100 mmol/L NaCl，100 μmol/L脫落酸（ABA），處理0、1、6、12、24、48 h后，稱取0.1 g樣品，參照植物RNA提取試劑盒說明書提取樣品總RNA。

根據(jù)獲得的cDNA序列，設(shè)計(jì)引物AmProTBD-S1（5'-ACGATTAGGCAGCCAGTTGT-3'）和Am-ProT-BD-F1（5'-GAAGGAGAGCCGCCA-CAAAT-3'），選定看家基因β-actin為內(nèi)參基因［Ac-tin F（5'-CTGACATGCGCCGTAGGAACG），Actin R（5'-CCCTGCTTATGCCAGTCTTTT）］。根據(jù)SYBR?Select Master Mix（Applied Biosystems by Life Technologies 公司）試劑盒說明書，于Bio-Rad CFX-96儀器上進(jìn)行qRTPCR。反應(yīng)體系為SYBR?Select Master Mix 10 μL、正反引物各0.4 μL、cDNA 2.5 μL、ddH2O 6.7 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，44個(gè)循環(huán)。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)共設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 AmProT基因的克隆與序列分析

利用簡并引物P1/P2擴(kuò)增獲得片段長度為1 236 bp。3'-RACE和5'-RACE分別獲得的片段長度為311 bp和206 bp（圖1）。將保守區(qū)，3'-RACE和5'-RACE三段cDNA序列進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果與拼接結(jié)果完全一致。AmProT基因全長1 587 bp（GenBank登錄號(hào)KJ873133），其中5'端非翻譯區(qū)（5'UTR）長61 bp，3'端非翻譯區(qū)（3'UTR）長197 bp，ORF長1 329 bp，編碼442個(gè)氨基酸（圖2）。

圖1 AmProT基因的PCR擴(kuò)增電泳

2.2 AmProT基因的生物信息學(xué)分析

通過ProtParam預(yù)測該基因編碼的蛋白分子式為C2253H3459N543O592S14，分子量為48.07 kD，等電點(diǎn)為9.32，屬于堿性蛋白質(zhì)。負(fù)電荷氨基酸（Asp+Glu）20個(gè)；正電荷氨基酸（Arg+Lys）30個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為26.38，屬于穩(wěn)定型蛋白（＜40蛋白穩(wěn)定），脂肪系數(shù)為110.77，平均親水性（GRAVY）0.617，預(yù)測該蛋白質(zhì)為疏水性蛋白。利用NCBI的Conserved Domains分析發(fā)現(xiàn)，AmProT蛋白與已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能數(shù)據(jù)庫中其他物種ProT具有相似的結(jié)構(gòu)功能域。運(yùn)用SignalP4.1程序?qū)roT編碼的蛋白序列進(jìn)行N端信號(hào)肽預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。通過TMHMM2.0預(yù)測可知，AmProT編碼的蛋白含有11個(gè)跨膜區(qū)域（圖3）。PSORT Prediction軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)膜的可信度為0.6，定位于高爾基體的可信度為0.4，定位于葉綠體類囊體膜的可信度為0.394，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可信度為0.3，因此認(rèn)為該蛋白最可能定位于細(xì)胞質(zhì)膜。

圖2 AmProT基因編碼的核苷酸及氨基酸序列

圖3 AmProT蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)與分析

利用在線Sopma預(yù)測AmProT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖4）表明，該蛋白由α-螺旋、延伸直鏈、無規(guī)則卷曲3種形式組成，其中α-螺旋包含218個(gè)氨基酸，占49.32%；延伸直鏈包含86個(gè)氨基酸，占19.46%；無規(guī)則卷曲包含138個(gè)氨基酸，占31.22%。

2.3 AmProT基因編碼蛋白系統(tǒng)的進(jìn)化分析

利用NCBI的Blast進(jìn)行AmProT基因編碼氨基酸序列的一致性比對(duì)，分析結(jié)果表明，其編碼的氨基酸序列與已克隆的其他植物基因編碼的氨基酸序列均有不同程度的相似性，與大豆基因相似性最高，為86%；與菜豆、豇豆、蒺藜苜蓿、桃、葡萄、擬南芥和番茄的相似性分別為83%、83%、83%、77%、75%、73%和72%。利用MEGA5.0構(gòu)建沙冬青ProT系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖5可見，沙冬青ProT蛋白與大豆（Glycine max）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、豇豆（Vigna unguiculata）在同一個(gè)小分支上，同源性最高。

2.4 AmProT基因在不同脅迫下的表達(dá)分析

2.4.1 AmProT基因的組織特異性表達(dá)分析 分別提取沙冬青地上部和地下部的總RNA，采用熒光定量PCR方法檢測ProT基因在這兩部分中的表達(dá)豐度，以看家基因β-actin為內(nèi)參基因。圖6顯示，AmProT基因在地上部和地下部中都有表達(dá)，在地上部的表達(dá)量要顯著高于地下部。

2.4.2 AmProT基因的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析 分別用干旱、鹽、脫落酸處理沙冬青幼苗，利用熒光定量PCR分析AmProT基因的表達(dá)模式。分析結(jié)果（圖7）表明，干旱［18%（W/V）的PEG-6000］處理可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，在處理之后1 h時(shí)表達(dá)量迅速升高，到6 h時(shí)略有下降，但仍高于本底表達(dá)，之后表達(dá)量隨時(shí)間的延長而上升，48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值。鹽（100 mmol/L的NaCl）處理后，表達(dá)量在1 h時(shí)迅速上升，6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，但仍高于本底值。脫落酸（100 μmol/L）處理后，該基因的表達(dá)量在1 h顯著提高，3 h略有下降，6 h時(shí)再次升高，并達(dá)到最高，之后，表達(dá)量隨時(shí)間的延長逐漸下降，但較本底表達(dá)仍然保持較高水平。

圖4 AmProT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 AmProT基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖6 AmProT基因的組織表達(dá)模式

3 討論

脯氨酸作為植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在應(yīng)對(duì)滲透脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用，研究表明，脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是植物體內(nèi)脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)配的功能基因［12-15］。本研究利用ProT基因家族高度保守的結(jié)構(gòu)域，首次克隆了沙冬青脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AmProT，從其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有11個(gè)跨膜區(qū)域的特征來看，其編碼的蛋白是典型的ProT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［26］。AmProT編碼的氨基酸序列與其他已克隆的植物基因編碼的氨基酸序列均有不同程度的相似性，其中與同屬豆科植物的大豆、菜豆、豇豆、蒺藜苜蓿的相似性較高，分別為86%、83%、83%、83%，說明了與同屬豆科的植物親緣關(guān)系較近，基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中保持較高的保守性。

脯氨酸的生物合成部位主要是在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和葉綠體中［27］，在滲透脅迫下，植物葉部合成的脯氨酸含量較高，根部合成的脯氨酸不足以滿足其對(duì)滲透脅迫的需求［28-31］。本研究的qPCR結(jié)果顯示，AmProT基因在沙冬青的地上部表達(dá)量顯著高于地下部，說明AmProT基因是一個(gè)在地上部中優(yōu)勢表達(dá)的基因。推測與葉片中大量合成的脯氨酸，需要大量的轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)。這與前人研究結(jié)果，即水稻的OsProT基因［13］和擬南芥AtProT3基因［17］主要在植株地上部中表達(dá)相一致。通過對(duì)AmProT的脅迫表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)量在干旱脅迫后呈現(xiàn)“升—降—升”的趨勢，產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能是因?yàn)锳mProT基因的轉(zhuǎn)錄受到反饋機(jī)制調(diào)節(jié)，在受到干旱脅迫時(shí)，蛋白維持在較高水平。在鹽脅迫和ABA處理下，AmProT基因在沙冬青體內(nèi)的表達(dá)表現(xiàn)出相似的趨勢，表達(dá)量先升高后降低，可能是受到這兩種脅迫時(shí)，該基因上游的正調(diào)控因子與該基因的啟動(dòng)因子結(jié)合激活了基因的表達(dá)，使其在脅迫后上調(diào)，之后略有下降，趨于平穩(wěn)。這也印證了ProT基因普遍存在于植物組織中，而表達(dá)水平受滲透脅迫誘導(dǎo)的觀點(diǎn)［12］。在本試驗(yàn)中，AmProT對(duì)干旱、鹽脅迫及脫落酸均有響應(yīng)，顯示其在植物脅迫響應(yīng)的過程中可能發(fā)揮重要作用，而其在抗逆過程中的生物學(xué)功能需要進(jìn)一步的研究。

圖7 AmProT基因的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式

4 結(jié)論

從沙冬青克隆獲得一個(gè)新的基因AmProT，該基因全長1 587 bp，編碼442個(gè)氨基酸，其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有11個(gè)跨膜區(qū)域，是ProT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)顯著特征。AmProT在地上部中優(yōu)勢表達(dá)，對(duì)干旱、鹽脅迫及脫落酸都能產(chǎn)生響應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Proline Transporter Gene in Ammopiptanthus mongolicus

Yue Guangzhen Jin Man Li Junlin Yang Shunying Guo Manyuan Su Yanhua
（State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture/Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing210008）

The cDNA of proline transporter gene in Ammopiptanthus mongolicus（GenBank accession No. KJ873133）was amplified by RACE technology. Bioinformatics analysis showed that the length of AmProT ORF was 1 329 bp， the gene encoded a putative polypeptide of 442 amino acids with a calculated molecular mass of 48.0733 kD and a theoretical pI of 9.32. It had 11 transmembrance domains， which is the typical characteristics of proline translocator. Phylogenic analysis indicated that AmProT was 86% similar to proline transporter gene of Glycine max. Real-time PCR analysis revealed that AmProT expressed in all tissues examined with more higher level in the above-ground part than the underground part； expression profiles under different stress treatments such as drought， salt and ABA were compared， and the results revealed that transcriptional level of AmProT was up-regulated. It is speculated that AmProT plays an important role in response to abiotic stresses such as drought and salt.

Ammopiptanthus mongolicus；proline transporter gene；gene cloning；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.017

2014-09-11

國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃項(xiàng)目（91125028）

岳光振，男，碩士研究生，研究方向：植物逆境生理生化特征；E-mail：biboqingyan@163.com

蘇彥華，男，博士，研究員，研究方向：分子植物營養(yǎng)學(xué)；E-mail：yhsu@issas.ac.cn