楊澤偉王龍海朱莉汪海黃大昉郎志宏

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽　621010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京　100081）

高粱SbGABA-Ts基因的克隆、原核表達及純化

楊澤偉1，2王龍海1，2朱莉2汪海2黃大昉2郎志宏2

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽621010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

植物中GABA（γ-氨基丁酸）代謝與植物生長發(fā)育、信號傳遞及逆境響應(yīng)等過程密切相關(guān)，而參與GABA代謝的關(guān)鍵酶GABA-T（γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶）在重要農(nóng)藝作物中的研究相對滯后。利用同源性分析在高粱基因組數(shù)據(jù)庫中獲得兩個γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（SbGABA-T）基因，RT-PCR方法進行基因克隆，并連入原核表達載體pET28a（+），轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）進行基因異源表達分析。結(jié)果表明，包含SbGABA-T編碼區(qū)全長的融合蛋白主要在包涵體中表達，而去除了SbGABA-T N端信號肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在。進一步優(yōu)化表達條件，IPTG濃度為1 mmol/L時，16℃低溫誘導(dǎo)18 h，即可獲得大量可溶性融合蛋白。用帶His標(biāo)簽的鎳柱對融合蛋白進行了純化。

高粱GABA-T；原核表達；純化；信號肽

作為糧飼能兼用的作物，高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］對全球農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的貢獻日益顯現(xiàn)［1］。按年產(chǎn)量計算，高粱是世界上第五大重要的谷類作物，僅次于玉米、小麥、水稻和大麥（http：// www.fao.org）。更值得注意的是，高粱具有其他作物無法比擬的多重抗逆性，在雨水稀少的美國南部平原和非洲東北部，以及中國東北和新疆廣闊的干旱

鹽堿地都有廣泛的種植。目前，已完成對美國優(yōu)良高粱自交系BTx623的測序［2］。高粱基因組的高密度遺傳圖譜、表達圖譜及基因功能鑒定等研究［3］，為玉米、小麥、大麥等禾谷類作物基因組研究提供極有價值的信息，是禾谷類作物的一個模式基因組。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動植物和各種微生物體內(nèi)，其合成與代謝通過TCA循環(huán)的一個旁路，即GABA旁路進行［4］。研究表明，GABA旁路途徑能通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)pH、碳氮代謝、蛋白質(zhì)降解、激素合成、活性氧形成、多胺代謝、信號傳遞等重要生理過程，繼而影響植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成及脅迫應(yīng)答［5-7］。

γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）是GABA分解代謝中的第一步關(guān)鍵酶。較之哺乳動物和微生物，植物中GABA-T基因的研究相對滯后。最近幾年，相繼從擬南芥、番茄、水稻中克隆到GABA-T基因，這些研究表明，GABA-T基因在亞型數(shù)量、亞細胞定位、組織發(fā)育豐度等各方面，隨植物種類的變化而表現(xiàn)出較大的差異，對脅迫的響應(yīng)也不盡相同［8-10］。干擾GABA-T基因的表達，擬南芥gaba-t/pop2突變體花粉管發(fā)育異常、種子產(chǎn)量降低，對鹽脅迫的耐受力下降［11］；番茄（Solanum lycopersicum L.）SlGABA-TRNAi轉(zhuǎn)基因植株后代出現(xiàn)嚴重的矮化和不育［12］；利用GABA-T專一性抑制劑vinyl-GABA（VGB）處理甘藍幼苗，其主根長度減少了約44%［13］，這表明GABA-T對于保障GABA的正常代謝，從而維持植株正常的生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答至關(guān)重要。

目前為止，有關(guān)GABA積累的確切生理學(xué)意義，及GABA旁路與其他生理進程間相互作用的分子機制仍不清楚，需要對GABA旁路途徑中關(guān)鍵基因及關(guān)鍵環(huán)節(jié)作進一步解析。相關(guān)的報道也多集中在擬南芥和煙草等模式植物中，在重要農(nóng)作物尤其是高粱中的研究還屬空白，關(guān)鍵的基因尚未得到克隆和鑒定，更不清楚GABA途徑是否在高粱多重抗逆性中扮演關(guān)鍵角色。本研究通過序列相似性比對和RT-PCR方法，首次從高粱基因組中克隆得到兩個候選SbGABA-T基因，將其在大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導(dǎo)表達，并利用鎳柱對融合蛋白進行純化，旨為高粱SbGABA-T蛋白的底物活性、催化機制的研究，以及進一步相關(guān)抗體的制備及免疫學(xué)方法的考察等奠定基礎(chǔ)，也為其他禾谷類作物相關(guān)基因的研究提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］自交系BTx623，由中國科學(xué)院植物所景海春課題組饋贈。

1.1.2 表達菌株及質(zhì)粒載體 本研究所用菌株E. coli DH5α、BL21（DE3）pLysS、克隆載體T-easy blunt購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。表達載體pET28a（+）購于Novagen公司。

1.1.3 工具酶及生化試劑 RNA提取所用的Trizol試劑購于Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Phusion高保真酶等購自NEB公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker（DL5000）、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒等均購自北京康為世紀生物科技有限公司；IPTG及其他生化試劑等購自于Sigma公司；引物合成及測序由北京中美泰和公司完成。

1.2 方法

1.2.1 SbGABA-T基因的cDNA擴增 以擬南芥（Arabidopsis）的GABA-T基因序列（GenBank Accession No.At3g22200）［14］在高粱全基因組數(shù)據(jù)庫（NC_01-2876）中進行比對，選取序列同源性較高的基因，在線分析程序NEW PLACE（https：//sogo.d n a.affrc. go.jp/）、TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/serv ices/ TargetP/）、PSORT（http：//psort.hgc.jp/ form.ht m l）分析其信號肽序列［15］。利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計開放閱讀框（ORF）全長引物（SbGABA-T表示）及去除N端信號肽后剩余區(qū)域（SbGABA-ΔT表示）的引物（下劃線為限制酶酶切位點）：

利用Trizol試劑提取高粱BTx623幼苗總RNA，并反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件為：98℃預(yù)變性30 s；98℃ 變性 10 s，58℃退火20 s；72℃延伸1 min，循環(huán)33次；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收所需大小的條帶，連接至克隆載體T-easy blunt，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，選取陽性轉(zhuǎn)化子送公司測序。

1.2.2 原核表達載體的構(gòu)建 提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，BamH I和Sac I雙酶切處理，所得片段連入相同酶切的pET28a（+）質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，涂布含卡那霉素（終濃度為50 mg/L）的LB平板。選取PCR陽性的克隆提取質(zhì)粒進行酶切驗證，同時送公司測序。鑒定正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21（DE3）pLysS中。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達 挑取BL21（DE3）pLysS陽性單菌落，接種至含卡那霉素（終濃度為50 mg/L）的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，所得培養(yǎng)物按1%接種至新鮮培養(yǎng)基；37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG溶液，16℃、200 r/min進行誘導(dǎo)表達［16，17］。設(shè)定IPTG誘導(dǎo)濃度梯度（終濃度）：0、0.25、0.5、1.0 mmol/L；及誘導(dǎo)時長梯度：10、14、18、22、34 h。分別取樣進行SDS-PAGE分析，以確定合適的誘導(dǎo)表達條件。

按確定的優(yōu)化條件進行誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，用PBS溶液（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，2 mmol/L PMSF，1% Triton-X-100）重懸，超聲波間歇處理破碎菌體。離心后，菌液上清與沉淀分別取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4 融合蛋白的純化 按Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書填充好鎳柱，平衡柱子后負載上樣（菌液上清），收集流穿液；依次用不同梯度的咪唑緩沖液進行目的蛋白的洗滌和洗脫，分別收集洗滌液和洗脫液。緩沖液成分為：20 mmol/L Tris-HCl（pH7.9），0.5 mol/L NaCl，10 -500 mmol/L咪唑。收集的液體分別取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 高粱SbGABA-T基因的cDNA克隆

根據(jù)已知的擬南芥AtGABA-T基因（GenBank Accession No.At3g22200）序列，在高粱基因組中數(shù)據(jù)庫（NC_012876）中進行Blast，獲得兩個候選GABA-T基因亞型（hypothetical protein，未注釋），本研究將其分別命名為SbGABA-T1（GenBank Accession No.XM_002445162）、SbGABA-T2（GenBank Accession No.XM_002 447046），其中，SbGABA-T1位于高粱基因組第7號染色體上，編碼509個氨基酸；SbGABA-T2則位于高粱基因組第6號染色體上，編碼511個氨基酸。SbGABA-T1、SbGABA-T2與擬南芥AtGABA-T的氨基酸序列相似性分別為73.11%和72.51%，兩亞型間的相似性為78.78%，且可變區(qū)域多集中在序列N端。進一步分析可知，其前端信號肽剪接位點分別在第30和第31位氨基酸位置。據(jù)此設(shè)計引物，以高粱BTx623品種cDNA為模板，分別克隆基因全長序列及截去N端信號肽后剩余部分序列，如圖1瓊脂糖凝膠電泳所示，基因全長大小約為1 500 bp，截去N端信號肽后大小約為1 400 bp，與預(yù)期的片段大小相符。將PCR產(chǎn)物連入克隆載體并測序，測序結(jié)果與公開數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列一致，表明高粱BTx623基因組中確實存在SbGABA-T1、SbGABA-T2兩個轉(zhuǎn)錄本。保守功能域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）表明，SbGABA-T1、SbGABA-T2均隸屬于乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT _Ⅰ）超家族，而γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶是該家族成員之一。

圖1 RT-PCR克隆高粱SbGABA-T基因

2.2 重組質(zhì)粒pET28a（+）-SbGABA-Ts的構(gòu)建

分別將SbGABA-T1、SbGABA-T2、SbGABA-ΔT1、SbGABA-ΔT2四個片段構(gòu)建到帶有His標(biāo)簽的原核表達載體pET28a（+）上（圖2-A）。相應(yīng)的重組質(zhì)粒pET28a（+）-SbGABA-Ts經(jīng)過BamHⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2-B所示，酶切后表達載體大小約為5 300 bp，目的片段大小約為1 500 bp和1 400 bp，符合預(yù)期。進一步測序結(jié)果表明目的基因均位于正確的讀碼框中，表明重組質(zhì)粒pET28a（+）-SbGABA-Ts構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a（+）-GABA-Ts的構(gòu)建

2.3 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-Ts誘導(dǎo)表達

條件

將構(gòu)建正確的重組表達載體利用熱激法轉(zhuǎn)入表達菌株E. coli BL21（DE3）pLysS后，進行融合蛋白的誘導(dǎo)表達。實驗中發(fā)現(xiàn)，無論如何優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件，如IPTG濃度、誘導(dǎo)時長等，SbGABA-Ts全長融合的目的蛋白表達量均非常少，且多集中在包涵體中，無法滿足下一步研究需要；而截去N端信號肽后的SbGABA-△T的融合蛋白，成功實現(xiàn)在可溶性組分中高效表達（圖3）。較之未加IPTG的對照組，加有IPTG誘導(dǎo)的實驗組在55 kD附近新增了一條蛋白條帶（圖3箭頭指示），與預(yù)期融合蛋白的分子量相符。

圖3 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-T1/△T1的誘導(dǎo)表達

進一步優(yōu)化表達條件，以轉(zhuǎn)化pET28a（+）-SbGABA-T1重組質(zhì)粒的菌株進行IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時長的探索，結(jié)果如圖4所示。加有IPTG的實驗組均成功實現(xiàn)重組蛋白的表達，盡管融合蛋白在包涵體中分布較多，但菌體破碎上清中仍有明顯目的蛋白的產(chǎn)生（圖4-A）。不同濃度IPTG作用下，融合蛋白表達量的差別并不明顯，表明融合蛋白的表達量受IPTG誘導(dǎo)濃度的影響有限。相對來說，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下的目的蛋白表達量在可溶性組分中分布最多，相應(yīng)地在包涵體中分布較少，表明1 mmol/L IPTG可以作為比較合適的誘導(dǎo)濃度。圖4-B表明，pET28a（+）-SbGABA-△T1重組蛋白表達量隨誘導(dǎo)時間的延長而增加，但增加幅度有限，考慮到誘導(dǎo)時間過長可能影響融合蛋白的結(jié)構(gòu)功能，選擇表達量相對較高的18 h作為最適的誘導(dǎo)時長。

2.4 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T的純化

根據(jù)優(yōu)化的誘導(dǎo)表達條件對重組菌BL21（DE3）/ pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2進行融合蛋白的大量誘導(dǎo)表達，并利用帶His標(biāo)簽的鎳柱進行目的蛋白的純化。如圖5-A、B所示，流穿液中目的蛋白的量明顯減少，表明目的蛋白已結(jié)合到鎳柱上，經(jīng)過梯度濃度的咪唑緩沖液洗滌后，雜蛋白被除去，最終目的蛋白在咪唑濃度為250 mmol/L時被洗脫下來，相應(yīng)的SDS-PAGE圖表明，純化的目的蛋白條帶單一，且濃度較高，能夠滿足進一步實驗的需要。

圖4 不同IPTG濃度及不同誘導(dǎo)時間下重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T1的表達

圖5 重組蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2的純化

3 討論

植物受各種逆境脅迫而快速積累GABA的現(xiàn)象已廣為人知［4-6］，近年的研究進一步表明，GABA途徑在植物胞質(zhì)pH調(diào)節(jié)、碳/氮源平衡、環(huán)境脅迫應(yīng)答、植株生長發(fā)育及形態(tài)建成等方面都發(fā)揮著重要的作用［5-7］。作為GABA分解代謝的關(guān)鍵基因，GABA-T對于維持GABA途徑的正常運轉(zhuǎn)具有重要意義，而植物中相關(guān)的研究一直比較滯后。近年來，隨著擬南芥、水稻、番茄等作物中GABA-T基因相繼被克隆，GABA-T在植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答中的作用才日益清晰［8-10］。本研究首次對高粱SbGABA-Ts基因進行了分離及原核表達分析。研究發(fā)現(xiàn)，不同于擬南芥中GABA-T基因的單拷貝，高粱中存在兩個GABA-T基因亞型，與番茄（Solanum lycopersicum L.）中相關(guān)基因亞型數(shù)量一致。GABA-T基因以基因家族形式存在，一定程度上有助于植物在干熱環(huán)境下光呼吸作用積累的乙醛酸的代謝，是植物適應(yīng)環(huán)境壓力的表現(xiàn)［8］。

多序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析表明，高粱SbGABA-T基因與已知的植物GABA-T基因的氨基酸序列相似性達到71%-88%，而且均隸屬于乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT_Ⅰ）超家族。但以往的研究證實，植物中GABA-T基因各亞型間的時空表達模式、亞細胞定位、蛋白酶活性等不盡相同，預(yù)示著植物中GABA-T基因各亞型間生理功能上的差異［8-10］。這種結(jié)構(gòu)與功能上的保守性和差異性，確保了GABA-T基因各亞型間在各種生理過程中既能“相互協(xié)作”，又能“各司其職”，體現(xiàn)了植物相關(guān)代謝調(diào)控的靈活和巧妙［18］。

GABA-T酶活的考察是GABA-T基因原核表達后重要的研究內(nèi)容之一。植物中GABA-T蛋白酶底物特異性的研究仍存在爭議。早期研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物、真菌、原核生物中的GABA-T多以α-酮戊二酸作為氨基受體［13］，而植物體內(nèi)GABA-T則表現(xiàn)出丙酮酸和α-酮戊二酸兩種活性［19］。但植物體內(nèi)酶活的研究不可避免的受到諸多因素的影響，如目標(biāo)蛋白酶提取效率低、分離困難、其他蛋白酶的干擾等［20］。對目的蛋白進行異源表達是研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能的有效手段。近期，Clark等［8］通過對擬南芥GABA-T體外重組表達分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥中GABA-T主要以丙酮酸和乙醛酸為氨基酸受體，而非α-酮戊二酸，類似的結(jié)果也相繼出現(xiàn)在番茄、水稻GABA-T的研究中［8-10］。植物中GABA-T酶具有乙醛酸底物活性的發(fā)現(xiàn)，進一步開拓了人們關(guān)于GABA途徑的傳統(tǒng)認知。乙醛酸作為植物光呼吸途徑的主要產(chǎn)物，表明GABA途徑可能與植物光呼吸途徑聯(lián)系［21］，由此推測，GABA-T能直接利用異檸檬酸降解而來的乙醛酸形成甘氨酸和第二個琥珀酸分子（GABA旁路中琥珀酸脫氫酶作用形成一分子琥珀酸），補充至TCA循環(huán)中，這有助于維持受脅迫植物在碳源不足的狀態(tài)下的能量供應(yīng)［22］。

本研究通過序列相似性比對和RT-PCR方法成功克隆到高粱兩個GABA-T基因，并利用pET28a（+）原核表達系統(tǒng)進行基因的異源表達分析，最終獲得了大量高質(zhì)量純化的重組蛋白，蛋白濃度分別達到965.46 ng/μL和893.09 ng/μL。值得注意的是，GABA-T基因編碼區(qū)全長融合的目的蛋白與去除了N端信號肽的目的蛋白在原核表達系統(tǒng)中的差異非常顯著，前者存在于包涵體中，且表達量有限；而后者雖然在包涵體中也有大量分布，但在可溶性組分中也有明顯的表達。一種解釋是原核細胞中缺乏相關(guān)的機制對誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)前體進行進一步加工，而去除了N端信號肽的GABA-△T是一種更接近于植物體內(nèi)成熟的GABA-T的存在形式，這對于目的蛋白在原核表達系統(tǒng)中表達量和可溶性的提高更為有益［8］。重組蛋白以可溶性形式存在，使后續(xù)的蛋白純化過程可以在無變性劑的相對溫和條件下進行，純化后的蛋白可以最大限度地保持其空間構(gòu)象與功能，這為今后高粱GABA-T酶活的分析、相應(yīng)抗體的制備及通過免疫學(xué)方法的深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為其他禾谷類作物相關(guān)基因的研究提供了參考和借鑒。

4 結(jié)論

通過序列相似性比對和RT-PCR方法首次克隆得到高粱兩個GABA-T基因，保守結(jié)構(gòu)域分析表明該基因均隸屬于乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT _Ⅰ）超家族。利用pET28a（+）原核表達系統(tǒng)進行基因的異源表達，表明SbGABA-T編碼區(qū)全長的融合蛋白主要在包涵體中表達，而去除了其N端信號肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在，且在1 mmol/L IPTG（終濃度）、16℃誘導(dǎo)條件下高效表達。經(jīng)Ni親和層析柱純化，250 mmol/L咪唑溶液洗脫，即可得到純化的融合蛋白。

［1］王海蓮， 管延安， 張華文， 等. 高粱基因組學(xué)研究進展［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2009（3）：549-556.

［2］Paterson AH， Bowers JE， Bruggmann R， et al. The Sorghum bicolor genome and the diversification of grasses［J］. Nature， 2009， 457（7229）：551-556.

［3］Morishige DT， Klein PE， Hilley JL， et al. Digital genotyping of sorghum-a diverse plant species with a large repeat-rich genome［J］. BMC Genomics， 2013， 14（1）：448.

［4］Bouché N， Fromm H， GABA in plants：just a metabolite？［J］. Trends in Plant Science， 2004， 9（3）：110-115.

［5］Shelp BJ， Mullen RT， Waller JC. Compartmentation of GABA metabolism raises intriguing questions［J］. Trends in Plant Science， 2012， 17（2）：57-59.

［6］ Shelp BJ， Bozzo GG， Zarei A， et al. Strategies and tools for studying the metabolism and function of γ-aminobutyrate in plants. II. Integrated analysis［J］. Botany， 2012， 90（9）：781-793.

［7］Fait A， Fromm H， Walter D， et al. Highway or byway：the metabolic role of the GABA shunt in plants［J］. Trends in Plant Science，2008， 13（1）：14-19.

［8］Clark SM， Di Leo R， Dhanoa PK， et al. Biochemical characterization，mitochondrial localization， expression， and potential functions for an Arabidopsis γ-aminobutyrate transaminase that utilizes both pyruvate and glyoxylate［J］. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（6）：1743-1757.

［9］Clark SM， Di Leo R， Van Cauwenberghe OR， et al. Subcellular localization and expression of multiple tomato γ-aminobutyrate transaminases that utilize both pyruvate and glyoxylate［J］. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（11）：3255-3267.

［10］Shimajiri Y， Ozaki K， Kainou K， et al. Differential subcellular localization， enzymatic properties and expression patterns of gamma-am-inobutyric acid transaminases（GABA-Ts）in rice（Oryza sativa）［J］. Journal of Plant Physiology， 2013， 170（2）：196-201.

［11］Renault H， Roussel V， El Amrani A， et al. The Arabidopsis pop2-1 mutant reveals the involvement of GABA transaminase in salt stress tolerance［J］. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）：20.

［12］Koike S， Matsukura C， Takayama M， et al. Suppression of gammaaminobutyric acid（GABA）transaminases induces prominent GABA accumulation， dwarfism and infertility in the tomato（Solanum lycopersicum L.）［J］. Plant and Cell Physiology， 2013，54（5）：793-807.

［13］ Deleu C， Faes P， Niogret MF， et al. Effects of the inhibitor of the gamma-aminobutyrate-transaminase， vinyl-gamma-aminobutyrate，on development and nitrogen metabolism in Brassica napus seedlings［J］. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 64：60-69.

［14］Palanivelu R， Brass L， Edlund AF， et al. Pollen tube growth and guidance is regulated by POP2， an Arabidopsis gene that controls GABA levels［J］. Cell， 2003， 114（1）：47-59.

［15］李立奇， 萬瑛. 蛋白質(zhì)的亞細胞定位預(yù)測研究進展［J］. 免疫學(xué)雜志， 2009（5）：602-604.

［16］Patnaik PR. Investigation of induction effect on the steady state performance of a continuous fermentation for recombinant β-ga1actosidase［J］. Process Biochemistry， 2001， 36（11）：1069-1074.

［17］ Akihiro T， Koike S， Tani R， et al. Biochemical mechanism on GABA accumulation during fruit development in tomato［J］. Plant and Cell Physiology， 2008， 49（9）：1378-1389.

［18］ Shelp BJ， Bown AW， McLean MD. Metabolism and functions of gamma-aminobutyric acid［J］. Trends in Plant Science， 1999， 4（11）：446-452.

［19］ Van Cauwenberghe OR， Shelp BJ， Biochemical characterization of partially purified gaba：pyruvate transaminase from Nicotiana tabacum［J］. Phytochemistry， 1999， 52（4）：575-581.

［20］Hyun TK， Eom SH， Jeun YC， et al. Identification of glutamate decarboxylases as a γ-aminobutyric acid（GABA）biosynthetic enzyme in soybean［J］. Industrial Crops and Products， 2013，49：864-870.

［21］ Allan WL， Simpson JP， Clark SM， et al. γ-Hydroxybutyrate accumulation in Arabidopsis and tobacco plants is a general response to abiotic stress：putative regulation by redox balance and glyoxylate reductase isoforms［J］. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（9）：2555-2564.

［22］Renault H. Fiat lux?。簆hylogeny and Bioinformatics shed light on GABA functions in plants［J］. Plant Signaling and Behavior，2013， 8（6）：e24274.

（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Prokaryotic Expression of Sorghum bicolor SbGABA-Ts

Yang Zewei1，2Wang Longhai1，2Zhu Li2Wang Hai2Huang Dafang2Lang Zhihong2
（1. Southwest University of Science and Technology，School of Life Science and Engineering，Mianyang621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081）

GABA is a ubiquitous four-carbon，non-protein amino acid，and has been associated with growth and development，signaling transduction，and stress response in plants. GABA transaminase（GABA-T），the enzyme responsible for the catabolism of GABA，has not been fully explored，especially in several important crops. Two putative GABA transaminase genes（GABA-T）from Sorghum bicolor were obtained based on homology analysis with the identified GABA-Ts of other plants and RT-PCR. Subsequently，the two SbGABA-T genes and corresponding N-terminal truncated SbGABA-Ts were inserted into pET28a（+）vector and individually imported into E. coli strain BL21（pLysS，DE3）. Percentage improvement of soluble recombinant proteins were showed when removing the targeting peptide sequence of SbGABA-Ts. The fusion proteins were expressed partially in soluble form after incubating for 18 h at 16℃ by adding 1 mmol/L IPTG，and purified through nickel-affinity chromatography column.

Sorghum bicolor GABA-T；prokaryotic expression；purification；signal peptide

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.015

2015-01-29

國家自然科學(xué)基金項目（31271790，31471558）

楊澤偉，男，碩士研究生，研究方向：植物抗逆機理；E-mail：yangzewei555@sina.com

朱莉，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)；E-mail：zhuli01@caas.cn