劉舒媛，張昌軍，彭海英，黃小琴，孫浩，林克勤，黃鎧，褚嘉祐，楊昭慶

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118；

2. 湖北省十堰市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，十堰 442000

精子端粒長(zhǎng)度與特發(fā)性男性不育相關(guān)

劉舒媛1，張昌軍2，彭海英2，黃小琴1，孫浩1，林克勤1，黃鎧1，褚嘉祐1，楊昭慶1

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118；

2. 湖北省十堰市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，十堰 442000

端粒是真核生物染色體末端的多功能特異性DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，覆蓋在染色體末端，保護(hù)基因組的穩(wěn)定性。端粒在減數(shù)分裂過(guò)程中起到了十分重要的作用，協(xié)助染色體配對(duì)、聯(lián)會(huì)、同源重組和分離。精子中的端?？赡茉诰拥氖芫芰团咛グl(fā)育中起到重要作用。近年來(lái)，端粒與生殖的相關(guān)性研究成為一個(gè)新的熱點(diǎn)，但精子端粒與男性不育間的相關(guān)性并不明確。本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)中國(guó)特發(fā)性男性不育人群（126例）和正常可育男性人群（138例）的精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性男性不育病例的精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（2.894±0.115）低于正常對(duì)照組（4.016±0.603），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=5.097×10-5）；并且精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度與精子密度、精子總數(shù)和精子活力都有顯著的相關(guān)性：精子數(shù)量較多和/或精子活力較高，精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)。研究結(jié)果提示，在中國(guó)人群中，精子端粒長(zhǎng)度與特發(fā)性男性不育具有相關(guān)性，精子的端粒長(zhǎng)度可能影響精子發(fā)生和精子的功能，精子端粒的縮短導(dǎo)致精子數(shù)目及活力的降低從而導(dǎo)致男性不育。

端粒長(zhǎng)度；特發(fā)性男性不育；精子數(shù)目；精子活力

全世界已婚孕齡夫婦存在生育困難的比率高達(dá)10%～15%，男女因素各占一半。男性精子發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，常染色體或者性染色體上的基因突變均有可能影響精子發(fā)生過(guò)程，從而導(dǎo)致男性不育［1，2］。目前仍有一些應(yīng)用現(xiàn)有手段不能找出病因的不育，很大一部分男性不育癥患者除精子異常外均正常，且精子異常原因不明，故稱(chēng)為特發(fā)性男性不育癥，約占男性不育癥的20%～30%［3］，包括特發(fā)性寡精癥（Oligozoospermia）、無(wú)精子癥（Azoospermia）、弱精子癥（Asthenzoospermia）和畸形精子癥（Teratozoospermia）4類(lèi)。

端粒是真核生物染色體末端的多功能特異性DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，端粒DNA是一系列富含G的高度保守重復(fù)序列（如人的重復(fù)序列為T(mén)TAGGG），端粒的長(zhǎng)度和端粒結(jié)構(gòu)都對(duì)端粒自身功能有十分重要的作用。端粒覆蓋在染色體末端，保護(hù)基因組的穩(wěn)定性。端粒在減數(shù)分裂過(guò)程中，協(xié)助染色體配對(duì)、聯(lián)會(huì)、同源重組和分離。在每次細(xì)胞分裂過(guò)程中，端粒長(zhǎng)度將程序性的縮短。這些核蛋白重復(fù)序列在精子中位于細(xì)胞核外圍并與組蛋白相結(jié)合，對(duì)氧化損傷極為敏感。

研究發(fā)現(xiàn)，精子中的端粒在小鼠的生殖能力和胚胎發(fā)育中具有重要的作用，端?？s短與小鼠精子DNA損傷以及人類(lèi)胚胎發(fā)育異常有關(guān)［4］。小鼠精子的染色體具有足夠長(zhǎng)度的端粒才能正常的受精，敲除端粒酶的小鼠由于缺乏端粒酶維持端粒的長(zhǎng)度，精子受精能力受損，并且無(wú)論是精子或是卵子的端粒縮短，都將造成受精卵的異常分裂和生長(zhǎng)［5］。如果人胚胎中的端粒很短，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)片段化，生成形態(tài)異常的胚泡然后凋亡［6］。端粒的長(zhǎng)度依靠端粒酶來(lái)維持，端粒酶在生殖細(xì)胞中高表達(dá)，這可能是隨著年齡的增加端粒在精子細(xì)胞中的長(zhǎng)度長(zhǎng)于體細(xì)胞的原因（人體細(xì)胞中端粒約5～10 kb，而生殖細(xì)胞中的端粒約10～20 kb）［7］。端粒酶活性降低和端粒長(zhǎng)度縮短會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡以及精子數(shù)量和受精能力降低［7］。

目前已發(fā)現(xiàn)許多疾?。ㄈ绨┌Y）與端粒長(zhǎng)度縮短有關(guān)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，男性不育患者精子的平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（0.674±0.028）顯著低于正常對(duì)照精子的平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（0.699±0.030，P＜0.005）［9］，精子端粒長(zhǎng)度與精子總數(shù)具有相關(guān)性，寡精子癥的精子平均端粒長(zhǎng)度（0.95±0.22）顯著低于正常精子的平均端粒長(zhǎng)度（1.24±0.25，P＜0.0001），且后代精子的端粒長(zhǎng)度與父母生育時(shí)的年齡有極大的相關(guān)性［10］。本文旨在分析精子端粒長(zhǎng)度在特發(fā)性男性不育人群和正?？捎行匀巳褐械牟町愐约岸肆ｉL(zhǎng)度與精液常規(guī)參數(shù)間的相關(guān)性，揭示端粒長(zhǎng)度與特發(fā)性男性不育的相關(guān)性。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取2008～2010年間在湖北省某醫(yī)院就診的特發(fā)性男性不育患者126例，年齡23～57歲，有3～5年不育病史，其配偶婦產(chǎn)科檢查正常。精液常規(guī)檢查參考2010年《WHO人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第五版）相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，正常精液標(biāo)準(zhǔn)為：精液體積≥1.5 mL，精子密度≥15×106個(gè)/mL，精子總數(shù)≥39×106個(gè)，精子活力a+b≥32%，精子活動(dòng)率≥58%，正常形態(tài)率≥4%，白細(xì)胞數(shù)＜1.0×106個(gè)/mL?；颊甙凑站悍治鼋Y(jié)果分層為：寡精癥（精子密度＜15×106/ mL或者精子總數(shù)＜40×106個(gè)，精子活力a+b≥32%）、寡弱精癥（精子密度＜15×106/mL或者精子總數(shù)＜40×106個(gè)，精子活力a+b＜32%）及弱精癥（精子密度≥15×106/mL或者精子總數(shù)≥40×106個(gè)，精子活力a+b＜32%）。選取同期在該院就診的健康已育男性138例作為正常對(duì)照，年齡22～52歲，精液常規(guī)檢查正常，精子密度≥15×106/mL，活動(dòng)力a+b≥32%。根據(jù)知情同意原則，分別收集病例和對(duì)照的精液樣本。

1.2精液樣本的收集和檢測(cè)

所有研究對(duì)象都經(jīng)過(guò)男科學(xué)基本檢查，包括精液常規(guī)檢測(cè)、體格檢查、激素檢查、既往疾病史問(wèn)詢(xún)、以及核型分析、Y-染色體微缺失檢測(cè)。精液常規(guī)檢測(cè)參照2010年《WHO人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第五版）［11］。精液樣本均在禁欲3～5天后，手淫法留取，收集精液標(biāo)本后置于50 mL潔凈燒杯中，37℃恒溫水浴箱內(nèi)30分鐘內(nèi)液化待檢。

液化精液經(jīng)Tris·HCl（pH6.8）洗滌后，置于-80℃凍存，臨用前取出。

1.3精子全基因組DNA提取

收集精液樣本，用酚-氯仿法提取精子全基因組DNA，紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳分別進(jìn)行DNA定量和定性檢測(cè)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定精子基因組端粒長(zhǎng)度

根據(jù)文獻(xiàn)［12，13］，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定基因組的端粒長(zhǎng)度。運(yùn)用樣本DNA端?？截悢?shù)（T）與單拷貝數(shù)內(nèi)參基因36B4拷貝數(shù)（S）的比值，即相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S比值）來(lái)評(píng)估各檢測(cè)樣本的端粒長(zhǎng)度。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，將細(xì)胞系HEK293T的基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋成：100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL和0.01 ng/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本基因組DNA（20 ng），均做3個(gè)平行復(fù)孔，使用BIO-RAD CFX-96熒光定量PCR儀（Hercules，CA，USA）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積20 μL，PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Green Master（北京康維生物），樣本DNA，引物5 pmol。端粒DNA的擴(kuò)增引物為：TelF 5'-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3'，TelR 5'-TCCCGACTATCCCTATCCCTTCCCTATCCCTATCCCTA-3'；內(nèi)參單拷貝基因36B4的擴(kuò)增引物：36B4F 5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3'，36B4R 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3'，引物由Invitrogen公司合成。定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃15 s，56℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，65～95℃熔解曲線5 s。

用BIO-RAD CFX Manager 3.1直接獲得樣本端粒DNA和內(nèi)參基因的CT值。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

特發(fā)性男性不育病例和正常對(duì)照間的相對(duì)端粒長(zhǎng)度差異用Student's t 檢驗(yàn)，精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度與精液常規(guī)參數(shù)間的相關(guān)性用Pearson相關(guān)（Pearson correlation，rp）檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS17.0 （SPSS Inc.， Chicago， IL， USA）軟件進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1病例和對(duì)照組間各項(xiàng)參數(shù)的比較

比較病例組和對(duì)照組患者的年齡、不育年限、禁欲時(shí)間以及精液常規(guī)參數(shù)（精液體積、精子密度、總精子數(shù)、精子活力和精子正常形態(tài)率）間的差異，發(fā)現(xiàn)精子密度、總精子數(shù)和精子活力在病例組和正常對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001或P＜0.05），其他參數(shù)在病例組和對(duì)照組間無(wú)差異（表1）。

表1　病例和對(duì)照間參數(shù)的比較

2.2病例和對(duì)照間精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度差異

特發(fā)性男性不育病例組（126例）的精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）（2.894±0.115）低于正常對(duì)照組（138例）（4.016±1.603），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=6.744× 10-10）。將特發(fā)性男性不育病例進(jìn)行分層，各亞層分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)弱精癥和寡弱精癥患者的精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）（3.022±0.119和2.088±0.717）均顯著低于正常對(duì)照組（4.016±1.603），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.030×10-6和P=1.072× 10-6），寡精癥的精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）（3.136± 0.885）也低于正常對(duì)照的精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（4.016±1.603，P=0.042）（圖1）。

圖1　精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）在特發(fā)性男性不育病例組與正常對(duì)照組間的比較

2.3相對(duì)端粒長(zhǎng)度與精液參數(shù)間的相關(guān)性

精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）與男性年齡、精子密度、精子總數(shù)、精子活力間的相關(guān)性用pearson相關(guān)（Pearson correlation，rp）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）與精子密度、精子總數(shù)和精子活力都有顯著的相關(guān)性，精子數(shù)量較多，精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)；精子活力較高，精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)（表2，圖2）。

3　討　論

端粒對(duì)于保持基因組的穩(wěn)定性和完整性具有重要的作用，目前發(fā)現(xiàn)許多疾病都與端粒長(zhǎng)度縮短有關(guān)聯(lián)。近年來(lái)端粒與生殖間的關(guān)聯(lián)性受到關(guān)注，端粒異?？赡軙?huì)導(dǎo)致生育障礙［14］。通常精子中的端粒很長(zhǎng)（10～20 kb），而體細(xì)胞中的端粒長(zhǎng)5～10 kb［7］，并且端粒的長(zhǎng)度可以遺傳到后代中。端粒的長(zhǎng)度依靠端粒酶來(lái)維持，端粒酶在生殖細(xì)胞中高表達(dá)。端粒酶缺失的精子（TR-/-）與正常卵子受精后，胚囊難以形成，胚胎分裂受阻甚至凋亡［5］。Ferlin等［15］提出，精子端粒長(zhǎng)度可作為研究精子發(fā)生和男性不育的一個(gè)新標(biāo)記，精子攜帶較短的端?？梢暈槭蔷影l(fā)生（Spermatogenesis）障礙的一個(gè)標(biāo)志［10］。Thilagavathi等［9］首先發(fā)現(xiàn)男性不育患者精子端粒長(zhǎng)度顯著低于正常男性精子；Ferlin等［10］在18～19歲的男性中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，精子端粒長(zhǎng)度與精子數(shù)目有相關(guān)性，寡精子癥的精子端粒長(zhǎng)度顯著低于正常精子的端粒長(zhǎng)度，并且后代精子的端粒長(zhǎng)度與父母生育時(shí)的年齡顯著相關(guān)［10］。本研究的結(jié)果顯示，中國(guó)人群中特發(fā)性男性不育病例（寡弱精癥、寡精癥、弱精癥患者）的精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度顯著低于正常可育男性的精子平均相對(duì)端粒長(zhǎng)度；并且精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度與精液精子總數(shù)和精子密度有顯著的相關(guān)性。本研究結(jié)果提示，端?？赡茉诰影l(fā)生過(guò)程中起到重要作用。由于聯(lián)會(huì)復(fù)合物配對(duì)紊亂將導(dǎo)致精子發(fā)生失?。?6］，而端粒在減數(shù)分裂過(guò)程中是協(xié)助染色體配對(duì)、聯(lián)會(huì)、同源重組和分離的重要元件，精子端粒的縮短可能導(dǎo)致精子減數(shù)分裂過(guò)程中聯(lián)會(huì)分離錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致精子發(fā)生受阻；或者端粒功能異常導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致精子數(shù)量降低。

表2　精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）與精液參數(shù)間的相關(guān)性

圖2　精子密度、精子總數(shù)和精子活力與精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S）的相關(guān)性

值得注意的是，本文研究發(fā)現(xiàn)，精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度的縮短與精子活力降低有相關(guān)性，這在以往的研究并未見(jiàn)類(lèi)似的結(jié)果。端粒在維持精子基因組穩(wěn)定性和完整性中起到了十分重要的作用，精子攜帶較短端粒，其DNA斷裂的比例升高［17］。精子核基因組的完整性對(duì)維持精子正常功能有重要作用，具有DNA損傷的精子勢(shì)必在結(jié)構(gòu)、精子活力和受精能力等方面有缺陷，最終導(dǎo)致不孕不育、胚胎發(fā)育異常、流產(chǎn)、死產(chǎn)和子代疾病以及影響輔助生殖結(jié)局。精子DNA損傷與精子密度、活力和精子正常形態(tài)率具有相關(guān)性［18］。精子端粒定位于精子細(xì)胞核外圍，與組蛋白相結(jié)合，保護(hù)精子基因組的完整性和穩(wěn)定性。精子端粒的損傷更加劇了精子DNA損傷。Thilagavathi等［9］對(duì)男性不育人群和正常人群中端粒長(zhǎng)度與精子DNA片段化和精子ROS水平進(jìn)行檢測(cè)，但未發(fā)現(xiàn)ROS水平、精子DNA片段化與精子端粒長(zhǎng)度間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，精子相對(duì)端粒長(zhǎng)度縮短與精子活力降低有相關(guān)性，這提示精子端?？s短與精子DNA損傷可能存在相關(guān)性，精子端?？s短可能會(huì)造成精子DNA損傷，從而造成精子活力降低和功能下降。但這一推測(cè)還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究表明，在中國(guó)人群中精子端粒長(zhǎng)度與特發(fā)性男性不育具有相關(guān)性：特發(fā)性男性不育患者精子端粒長(zhǎng)度顯著低于正常男性精子，并且精子端粒的長(zhǎng)度縮短與精子數(shù)量減少和精子活力降低具有相關(guān)性，即精子的端粒長(zhǎng)度可能影響精子發(fā)生和精子的功能，精子端粒的縮短導(dǎo)致精子數(shù)目及活力的降低從而導(dǎo)致男性不育。同時(shí)，精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受到遺傳因素和環(huán)境因素的復(fù)雜調(diào)控。環(huán)境因素如：毒素、感染、氧化壓力、生活習(xí)慣（如吸煙酗酒）、肥胖等都會(huì)影響精子發(fā)生過(guò)程和精子功能，這些因素也是可能導(dǎo)致端?？s短的因素［7］。因此，環(huán)境因素如氧化壓力等與端粒間的相互作用以及端粒影響精子發(fā)生和精子功能的機(jī)制值得深入研究。本研究為男性不育的遺傳與環(huán)境因素相互作用機(jī)制/病理生理意義提供了更多線索，有待進(jìn)一步在更多病例和人群中進(jìn)行驗(yàn)證，并深入開(kāi)展功能學(xué)方面的研究。

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（責(zé)任編委： 苗龍）

Association study of telomere length with idiopathic male infertility

Shuyuan Liu1， Changjun Zhang2， Haiying Peng2， Xiaoqin Huang1， Hao Sun1， Keqin Lin1，Kai Huang1， Jiayou Chu1， Zhaoqing Yang1

1. Institute of Medical Biology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical college， Kunming 650118， China;
2. Reproductive of Medical Research Centre of People’s Hospital of Shiyan， Shiyan 442000，China

Telomeres are evolutionary conserved， multifunctional DNA-protein complexes located at the ends of eukaryotic chromosomes. Telomeres maintain chromosome stability and genome integrity and also play an important role in meiosis which aid in synapsis， homologous recombination， and segregation. Sperm telomere has been reported to play an important role in fertilization and embryo development. Nowadays， the association between telomere and reproduction is one of the major areas of interest， however whether sperm telomere associated with male infertility is not clear. In this study， in order to find out the association between Chinese idiopathic infertility and sperm telomere length， we analyzed the difference of sperm telomere length between idiopathic infertile men and normal fertile men，as well as the correlations between sperm telomere length and human semen characteristics. We analyzed 126 Chineseidiopathic infertile men and 138 normal fertile men for sperm telomere length by using quantitative PCR. We found that the relative sperm mean telomere length of infertile men was significantly shorter than that of fertile men（2.894±0.115 vs. 4.016±0.603， P=5.097×10-5）. Both sperm count and semen progressive motility are related with telomere length. Our results suggest that sperm telomere length is associated with idiopathic male infertility of China and we proposed the possibility thatshorter telomeres in sperm chromosome will reduce spermatogenesis and sperm functions， which finally affected the fertility of male.

telomere length； idiopathic male infertility； sperm count； sperm total motility

2015-06-05；

2015-08-19

國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（編號(hào)：2012AA021802）資助

劉舒媛，博士，助理研究員，研究方向：疾病的遺傳相關(guān)性。E-mail： liushuyuan@imbcams.com.cn

楊昭慶，博士，研究員，研究方向：疾病的遺傳相關(guān)性。E-mail： zyang@imbcams.com.cn

10.16288/j.yczz.15-267

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間： 2015-8-289：25：49

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150828.0925.004.html