李 楠 白宏英

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

腦梗死是繼惡性腫瘤、心肌梗死后第三大嚴(yán)重影響人類健康的疾病。同時(shí)是致殘率最高的原因。腦梗死是當(dāng)今世界成人死亡和致殘的主要原因之一，2008年調(diào)查顯示，腦梗死已成為中國(guó)人口致死的首要原因。由于急性腦梗死的溶栓時(shí)間窗限制（發(fā)病后3～6h），溶栓治療受益率極低，目前對(duì)大部分病人存在的神經(jīng)功能損傷尚無確實(shí)有效的臨床治療手段。腦梗死組織周邊炎性免疫反應(yīng)的輕重與梗死后神經(jīng)損害程度密切相關(guān)［1］。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，本研究擬動(dòng)態(tài)觀察腦梗死后CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)，探討其在腦梗死后的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性wistar大鼠40只（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心培育），體質(zhì)量200～220g，隨機(jī)分為5組，分別為大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）24h、72h、1周、2周組和假手術(shù)組，每組8只。采用線栓法制作MCAO 模型，術(shù)后24h動(dòng)物清醒后，應(yīng)用Zea等［4］方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展左前肢；2分：行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：自主行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：存在意識(shí)障礙。l～3分定義為模型制作成功，模型制作不成功者隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2 外周血中CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的檢測(cè) 大鼠麻醉后心 臟 取 血，依 次 加CD4－FITC lμL、CD25－Percp 和Ig－Glk－Percp0.5ul（美國(guó)eBoiscience公司）到檢測(cè)管和對(duì)照管，加0.5mL破膜液（博士德生物技術(shù)有限公司），4 ℃冰箱（日本三洋電機(jī)公司）孵45 min，加2 mL 破膜液，加Foxp3－PE和IgG2ak－PE 5ul（美國(guó)eBoiscience公司），洗滌1次；加0.5 mL 1%的多聚甲醛重懸，上流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）檢測(cè)，進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析（ANOVA），變量間用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MCAO 組外周血中CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)在模型制備后24h、72h時(shí)與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在1周、2周時(shí)明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同時(shí)間水平之間CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)有顯著差異性（P＜0.05）。見表1。梗死后的24h、72h、1周、2周CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)逐漸增高，而假手術(shù)組表達(dá)相對(duì)保持恒定，無顯著變化趨勢(shì)。不同組別的表達(dá)有顯著差異性，MCAO 組明顯高于假手術(shù)組（P ＜0.01）。時(shí) 間 與 分 組 之 間 有 顯 著 交 互 效 應(yīng)（P ＜0.01），但變化趨勢(shì)不同。見表2。

表1 2組不同時(shí)期CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá) ［n（%）］

表2 CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表達(dá)的時(shí)間和分組效應(yīng)分析 ［n（%）］

3 討論

腦梗死日益呈增長(zhǎng)及年輕化趨勢(shì)，致殘率和病死率逐年增高，嚴(yán)重威脅人們健康和生命。已經(jīng)證實(shí)腦梗死后的炎癥反應(yīng)會(huì)加重顱腦受損部位的腦損傷，甚至有人認(rèn)為腦內(nèi)過度表達(dá)的炎性反應(yīng)對(duì)病灶區(qū)腦組織的損傷比缺血本身更嚴(yán)重。所以對(duì)過度表達(dá)的炎性反應(yīng)的抑制，越來越受到人們的關(guān)注和研究。近年來，多個(gè)課題組通過對(duì)外周免疫的大量研究證實(shí)，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞對(duì)其維持起重要作用。隨著對(duì)CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在體內(nèi)、外具體機(jī)制的深入研究，已經(jīng)證實(shí)其具有免疫抑制性和免疫無能性兩大特征。而其具有的對(duì)效應(yīng)性T 細(xì)胞的抑制特性，使其在腦梗死后的機(jī)制成為近期研究的熱點(diǎn)。

研究表明，炎癥因子和趨化因子在腦梗死后增高，腦梗死后缺血灶周圍活躍的炎癥反應(yīng)，如細(xì)胞因子、趨化因子、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子和蛋白酶的活動(dòng)等，會(huì)加重腦組織損傷［2］，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞主要在機(jī)體免疫中通過復(fù)雜的作用機(jī)制維持外周免疫耐受，限制效應(yīng)細(xì)胞的應(yīng)答程度，從而防止過度免疫反應(yīng)所致的組織損傷，發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。Brusko等［3－4］認(rèn)為，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞具有免疫抑制作用，既可抑制CD4＋和CD8＋效應(yīng)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，也可抑制樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的功能，可有效抑制反應(yīng)性T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌，繼而可能改善腦梗死的結(jié)果。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可能在梗死后神經(jīng)功能的再生和修復(fù)中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間點(diǎn)隨著CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)增多，表明CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性對(duì)腦梗死有潛在的腦保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

［1］ Offner H，Vandenbark AA，Hum PD.Effect of experimental stroke on peripheral immunity：CNS ischemia induces profound immunosuppression［J］.Neuroscience，2009，158（3）：1 098－1 111.

［2］ Gee JM，Kalil A，Shea，C，et al.Lymphoeytes：pomntial mediators of postischemic injury and neuroprotection［J］.Stroke，2007，38（2Suppl）：783－788.

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［4］ Cuenca－López MD，Biea D，Galindo MF.Inf1ammatory response during ischemic processes：adhesion molecu1es and immunomodulation［J］.Rev Neurol，2010，51（1）：30－40.