阮志華等

【摘要】內(nèi)皮微粒（Endothelial Microparticle，EMP）是由內(nèi)皮細(xì)胞釋放的微小囊泡狀顆粒。內(nèi)皮損傷是缺血再灌注損傷（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）的重要環(huán)節(jié)，EMP反映內(nèi)皮損傷并通過不同機制參與IRI的發(fā)生發(fā)展。本文就EMP的生成、生物學(xué)特征和檢測以及在IRI中的作用做一概述。

【關(guān)鍵詞】內(nèi)皮微粒；缺血再灌注；損傷

【中圖分類號】R722.12 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0765-01

缺血再灌注損傷是指在缺血一定時期的基礎(chǔ)上恢復(fù)組織器官的血流供應(yīng)，不僅不能減輕其缺血性損害，反而加重功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象，臨床上常見于冠心病、心血管手術(shù)及移植手術(shù)等。內(nèi)皮微粒是內(nèi)皮細(xì)胞在激活或凋亡情況下釋放的一種由磷脂膜包被的微小囊泡狀物質(zhì)，在凝血、炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)皮損傷等方面發(fā)揮作用。內(nèi)皮損傷是IRI進程中的一個重要環(huán)節(jié)，由內(nèi)皮細(xì)胞釋放的EMP也在此進程中發(fā)揮作用，有研究[1-2]證實EMP參與IRI，對內(nèi)皮功能有影響。有關(guān)EMP的研究越來越多，對其來源、特征及在疾病發(fā)生發(fā)展過程中所起作用已經(jīng)有了一定程度的了解。

1 EMP生成與檢測

1.1 EMP的生成

血液中微粒種類根據(jù)其來源可分為血小板微粒、內(nèi)皮微粒、紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒等。Hamilton[3]于1990年利用C5b-9補體蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放囊泡，首次檢測出一種直徑<1μm的顆粒，命名為EMP。EMP 的研究多源于體外分離或培養(yǎng)的細(xì)胞，體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞生成EMP的機制仍不明確，但普遍認(rèn)為與內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)，也有研究認(rèn)為理化因素引起的細(xì)胞激活或凋亡可導(dǎo)致EMP生成。Chironi[2]認(rèn)為EMP的產(chǎn)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放增加有關(guān)，細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成，內(nèi)層含有磷脂酰絲氨酸（PS），當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子突然增加改變了跨膜穩(wěn)定狀態(tài)時，細(xì)胞骨架纖維斷裂，使得內(nèi)層的PS外翻，細(xì)胞膜上囊泡形成并釋放到細(xì)胞外液中形成EMP。Leroyer[4]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡過程中會產(chǎn)生EMP。一些促炎、促凋亡、及氧化性物質(zhì)也可刺激EMP釋放，Combes等人最早于1999年即發(fā)現(xiàn)TNFα可以刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放EMP，其它如IL-1β、脂多糖、氧化應(yīng)激等均有此作用；某些疾病如糖尿病、肺動脈高壓等亦可導(dǎo)致EMP釋放增加[5-8]。Wang[9]等人的研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，內(nèi)皮型一氧化氮合酶的解耦連也參與EMP的生成，這說明EMP與一氧化氮依賴性的內(nèi)皮功能不全可能存在某種相關(guān)性。

1.2 EMP的特征與檢測

微粒的成分由其來源所決定，包括含磷脂的脂質(zhì)雙分子層、膜表面蛋白、膜內(nèi)容物等，內(nèi)皮細(xì)胞來源的EMP主要包含有代謝相關(guān)的酶類，參與粘附和融合過程的蛋白及一些細(xì)胞骨架蛋白[10] 。對于EMP的膜內(nèi)容物目前所知甚少，可能含有少量核碎片及細(xì)胞質(zhì)。EMP含有內(nèi)皮細(xì)胞成分，因此可以采用相關(guān)抗體作用于上述成分所表達(dá)的抗原以檢測并確定EMP來源[11]。正常內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的磷脂分布具有不對稱性，在活化或凋亡的細(xì)胞，這種不對稱性消失，導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層外層PS增加，EMP表面PS同樣如此。PS在止血和凝血方面具有重要的意義，可與凝血因子結(jié)合，啟動凝血過程，對受損部位凝血過程起到調(diào)節(jié)作用，這也表明EMP的釋放可能會影響凝血功能，增大血栓形成風(fēng)險[12]。PS能特異性的與非EMP膜蛋白annexin V結(jié)合，利用熒光素標(biāo)記的annexin V與PS相結(jié)合即可檢測到EMP的存在。Annexin V的缺點是敏感性及特異性均不足，因此還可以利用EMP膜蛋白成分來對其進行檢測。EMP的表面攜帶有特異性抗原分子，不同疾病情況下EMP表面攜帶抗原表型有所不同，包括CD31、CD62E、CD144等多種分子，而有些抗原分子如CD42則不表達(dá)。EMP主要來源于內(nèi)皮細(xì)胞，因而表達(dá)多種內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞激活或凋亡過程中也會出現(xiàn)一些新的成分。Chironi等總結(jié)了近十余年的多項研究，發(fā)現(xiàn)不同情況下EMP的免疫表型有所不同，在急性冠脈綜合征、嚴(yán)重高血壓、1型糖尿病、肺動脈高壓等多種疾病過程中，EMP的抗原分化群呈現(xiàn)不同的表型特征，例如抗原表型為CD31+/CD42-的EMP可見于嚴(yán)重高血壓患者，而抗原表型為CD31+/ CD42-/ CD62E+的EMP則可見于代謝綜合征患者[13-14]。在流式細(xì)胞儀檢測時，利用相應(yīng)抗體檢測EMP的抗原表達(dá)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)微球來確定EMP直徑范圍即可精確測定某種疾病狀態(tài)下的EMP含量。除此之外，還可以用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定EMP，但其應(yīng)用遠(yuǎn)不如流式細(xì)胞儀檢測法廣泛。

2 EMP與缺血再灌注損傷

缺血再灌注過程中，微循環(huán)缺血及后續(xù)的再灌注過程首先影響內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能障礙，受損的內(nèi)皮細(xì)胞釋放EMP，釋放的EMP不僅反映內(nèi)皮損傷的程度，而且還作用于內(nèi)皮細(xì)胞本身并參與炎癥反應(yīng)、凝血/血栓形成等多個過程，從而參與并導(dǎo)致IRI。上述進程形成了一個缺血再灌注—內(nèi)皮損傷—EMP釋放—加重缺血再灌注損傷的通路。

2.1 缺血再灌注與內(nèi)皮損傷

IRI發(fā)生機制的研究較多，普遍認(rèn)為與氧自由基增多、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、能量代謝障礙、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥因子釋放及凝血異常等有關(guān)。缺血再灌注過程直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變和功能受損。缺血再灌注時產(chǎn)生的大量氧自由基對膜磷脂、細(xì)胞骨架、核酸有損傷作用，這可能是內(nèi)皮損傷導(dǎo)致EMP生成的原因之一，Kim[15]的研究也證實了抑制活性氧簇（ROS）生成對減輕IRI有一定作用。Ca2+超載導(dǎo)致線粒體功能障礙，細(xì)胞能量供應(yīng)不足，促使進氧自由基生成，生成的氧自由基又進一步加重Ca2+超載，二者形成惡性循環(huán)，加重內(nèi)皮損傷。由于缺血導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞能量供應(yīng)不足，ATP減少，細(xì)胞代謝異常、水腫，進而微血管舒縮功能異常，再灌注期局部出現(xiàn)“無復(fù)流”現(xiàn)象使得損傷進一步加重[16-19]；再灌注后炎癥介質(zhì)大量釋放，引起內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)，使中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附并釋放氧自由基及破壞性蛋白酶，損傷內(nèi)皮。內(nèi)皮細(xì)胞不僅構(gòu)成血管屏障，還有分泌功能，釋放多種生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)，內(nèi)皮損傷在IRI中主要表現(xiàn)為抗氧化能力下降和血管活性物質(zhì)的釋放異常。內(nèi)皮細(xì)胞可合成釋放一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素（ET）、前列腺環(huán)素（PGI2）等物質(zhì)，缺血再灌注時NO合成減少而ET、PGI2則增加，導(dǎo)致血管異常收縮出現(xiàn)無復(fù)流現(xiàn)象，加重組織缺血缺氧。有研究表明[20]內(nèi)皮系統(tǒng)的抗氧化活性與對氧化活性的敏感性存在相關(guān)性，缺血再灌注時內(nèi)皮細(xì)胞清除活性氧能力降低，同時對外源性活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)的敏感性增加，導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，進而損傷細(xì)胞。

2.2 EMP參與缺血再灌注損傷

在IRI過程中，EMP由受損的內(nèi)皮細(xì)胞釋放，EMP的產(chǎn)生不僅是IRI對內(nèi)皮細(xì)胞的作用結(jié)果，同時也參與IRI進程。EMP可以反過來作用于內(nèi)皮細(xì)胞本身，使其損傷進一步加重。逢利[21]通過對大鼠心肺復(fù)蘇后細(xì)胞膜微粒變化的研究，發(fā)現(xiàn)EMP的含量增加，認(rèn)為EMP參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程。Ci HB等[22]發(fā)現(xiàn)二尖瓣疾病患者的EMP含量增加，進而減少二尖瓣內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成，而使超氧化物陰離子（O2-）的含量增加，最終損傷內(nèi)皮細(xì)胞，其損傷機制可能是通過抑制Akt/eNOS-HSP90信號通路而發(fā)揮作用。區(qū)景松等研究發(fā)現(xiàn)，EMP抑制熱休克蛋白90（HSP90）與內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）結(jié)合，使eNOS解偶聯(lián)而刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生O2-，產(chǎn)生的O2-不僅直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，同時還參與IRI進程。EMP可以明顯抑制內(nèi)皮依賴的血管舒張功能，其機制為抑制內(nèi)皮細(xì)胞生成具有舒血管作用的NO，這可能也是再灌注組織發(fā)生“無復(fù)流”現(xiàn)象而加重?fù)p傷的原因之一，陸永光等人的研究也部分性的證實了這一點[23-25]。Chirions[26]等發(fā)現(xiàn)EMP含量與血液中IL-6的水平正相關(guān)，EMP可以通過其表面的CD62E結(jié)合到中性粒細(xì)胞上，使之激活，說明EMP與炎癥反應(yīng)之間有一定關(guān)系，這也可能是EMP在IRI中發(fā)揮作用的途徑之一。吳志宏[27]等研究發(fā)現(xiàn)EMP在體外可以促進內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，可能與EMP影響內(nèi)皮細(xì)胞酶激活因子1，使其激活Caspase-3，而Caspase-3是凋亡信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子，可以促進細(xì)胞凋亡。EMP能激活NF-κB信號通路，該通路的活化參與了許多促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，同時NF-κB還可以調(diào)控細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）的表達(dá)，而ICAM-1介導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞的粘附被認(rèn)為是血管損傷后炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，這也是EMP介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與IRI的途徑之一。膿毒癥時EMP表達(dá)組織因子（TF），TF轉(zhuǎn)移到血小板上啟動凝血過程，導(dǎo)致血栓形成，可繼發(fā)性的導(dǎo)致微循環(huán)障礙加重組織缺血缺氧。Chirinos研究認(rèn)為，血栓形成除了與EMP釋放有關(guān)外，還與EMP-白細(xì)胞、血小板-白細(xì)胞結(jié)合物形成有關(guān)，說明EMP參與凝血過程，這也許是缺血后的再灌注過程中，EMP導(dǎo)致凝血異常，進而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，加重組織損傷的機制之一。

EMP現(xiàn)已經(jīng)被認(rèn)為是一種新的診斷內(nèi)皮功能不全的標(biāo)志物，反映了內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀況。在IRI過程中，EMP的產(chǎn)生繼發(fā)于缺血及再灌注導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷，EMP攜帶的生物學(xué)標(biāo)志物具有相應(yīng)功能，參與炎癥反應(yīng)、凝血/血栓形成，影響內(nèi)皮依賴性血管舒張，因此可以通過上述途徑影響IRI的發(fā)生發(fā)展。對EMP的來源、特征及其在IRI中生物學(xué)活性的作用機制研究有助于進一步了解IRI的發(fā)生機制及防治，為IRI的發(fā)生機制及診斷、治療的研究提供了新的方向。

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