楊欣建

【摘要】目的：研究在正常人的椎間盤與退變的椎間盤髓核細胞中TGF-β1基因是否表達，表達含量的差異，探討這些基因表達量的高低與退變椎間盤的關(guān)系。方法：利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測TGF-β1基因在正常人與退變椎間盤髓核細胞中的表達含量。結(jié)果：TGF-β1在退變的椎間盤細胞表達較正常椎間盤升高，有一定豐度。結(jié)論：TGF-β1基因在人椎間盤中表達。人退變的的椎間盤與TGF-β1高表達相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】椎間盤退變；轉(zhuǎn)化因子-β1；基因

【中圖分類號】R681.5 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0274-02

椎間盤退變?yōu)榧怪饪瞥Ｒ娂膊≈唬R床上約20%的下腰痛由椎間盤退變引起[1]，已成為臨床腰痛的主要原因。引起椎間盤退變的原因仍不明確，目前學說主要以基因?qū)W說[2]、細胞因子學說[3]等?；?qū)W說已成為近年來研究熱點，其中尤以轉(zhuǎn)化因子-β1（TGF-β1）基因為學者所熱衷。TGF-β1為TGF-β家族中的一種亞群，有研究表明，TGF-β家族基因具有調(diào)節(jié)細胞增殖與分化、細胞凋亡、遷移和黏連等廣泛功能[4]。TFG-β1是否在退變椎間盤中表達，與椎間盤退變是否有內(nèi)在聯(lián)系，至今仍未研究清楚。本文擬行實時熒光定量（qRT-PCR）研究TFG-β1基因與椎間盤退變的表達與相互關(guān)系，探討引發(fā)椎間盤退變的可能原因。

1、 材料與方法

1.1 實驗標本來源 標本均收集自深圳市二醫(yī)院脊柱外科2013年1月至2014年9月行腰椎后路髓核摘除+椎間融合+內(nèi)固定植骨融合術(shù)的患者。按照術(shù)前椎間盤退變的影像學資料，即為 MRIT2加權(quán)像Pfirrmann的標準[5]加術(shù)后病理切片結(jié)果分為實驗組與對照組。實驗組為腰椎間盤突出癥、術(shù)前椎間盤MRI Pfirrmann分級為IV級，術(shù)后病理結(jié)果提示椎間盤髓核退變的患者16例，其中男性10例，女性6例，平均年齡（47.5±12.1歲），對照組為腰椎爆裂骨折脫位，術(shù)前椎間盤MRIT2椎間盤信號正常，術(shù)后病理為正常椎間盤組織，需摘取椎間盤融合的患者，共8例，其中男性5例，女性3例，平均年齡（43.6±13.2歲）。

1.2 標本處理 在術(shù)中取出椎間盤后，立即用生理鹽水反復沖洗干凈，后放置于標本袋中，加入RNA固定液，冰凍于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

1.3實驗方法

1.31 Trizol提取總RNA

取100mg的組織樣，在液氮中研磨，充分研磨后移至預加了1ml TRIzol試劑（LifeTechnologies公司）的EP管中，按相關(guān)說明書加入試劑，并跑膠，相關(guān)引物如下：h-TGFB1-QPCR-F：5-GAGAAGCGGTACCTGAACCC-3；h-TGFB1-QPCR-R： 5-GGCGAAAGCCCTCAATTTCC-3。

1.32 RNA反轉(zhuǎn)錄

使用TOYOBO公司Rever-Tra-Ace-α-試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，使用Random與Oligo（dT）20混合引物。按說明書操作，隨機引物反轉(zhuǎn)，反應完成后放置負20℃冰箱保存。

1.33定量PCR檢測 使用SYBR Green染料進行熒光定量PCR檢測。

1.4統(tǒng)計學處理

應用spss 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理， 各組數(shù)據(jù)均采用 x± s表示，采用 χ2 檢驗；標準均數(shù)間比較，采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。

2、實驗結(jié)果

2.1組別特征：實驗組平均年齡47.5±12.1歲，對照組平均年齡43.6±13.2歲，經(jīng)t檢驗，發(fā)現(xiàn)兩組年齡無差異（p>0.05）。

2.2實驗組TGF-β1基因在退變椎間盤及正常椎間盤均表達。在退變椎間盤中表達含量較高，在正常椎間盤組織中，表達含量較低。其絕對定量分別為：實驗組X±s： 8.61±1.28，，對照組為X±s：1.00±0.09，與對照組比較，p<0.05，具有統(tǒng)計學意義。

3、討論

TGF-β1基因是一類細胞生長因子調(diào)控基因，在全身多個組織中均可表達，調(diào)控著細胞的分化、免疫、代謝、凋亡等功能。 TGF-β1基因為TFG-β超家族的一員，分子量約為25kD，其存在多個基因的多態(tài)性情況，這些基因的多態(tài)性直接影響著 TGF-β1在機體中的功能情況。

對于椎間盤退變的機制仍未研究透徹，有研究顯示，TGF-β1基因在椎間盤中過度表達可促使椎間盤髓核細胞進一步纖維化，從而加重椎間盤退變[6]。本實驗中，退變組TGF-β1的mRNA表達量明顯高于正常椎間盤TGF-β1mRNA含量，與之研究理論相符合。同時有學者發(fā)現(xiàn)，TGF-β1基因的過度表達，可直接導致椎間盤I型與III型膠原的增加，改變了椎間盤組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，引發(fā)退變，TGF-β1基因過度表達被認為與人退變椎間盤高度相關(guān)。[7]

于此同時，有學者研究表明少量TGF-B1的表達，通過其生理調(diào)節(jié)作用，對椎間盤具有保護效益，使纖維環(huán)外層I型膠原含量聚集，Ⅲ型膠原則主要分布于纖維環(huán)細胞周圍，加強了椎間盤穩(wěn)定性，減少椎間盤退變的幾率。[8]本實驗中，正常椎間盤組中亦有少量TGF-β1的mRNA表達，屬于其基礎含量表達，這表明TGF-β1的少量表達在髓核中維持著椎間盤的穩(wěn)定，避免其進一步退化。

總而言之，TGF-β1在椎間盤不同時期發(fā)揮不同作用的特點，早期基礎量的TGF-β1對椎間盤起著保護作用，至嚴重退變期，TGF-β1的過表達與退變高度相關(guān)。目前TGF-β1基因調(diào)控的具體細胞信號通路，與椎間盤內(nèi)環(huán)境、外在環(huán)境的相關(guān)影響關(guān)系仍未研究清楚，值得進一步的研究。

參考文獻

[1] DAGENAISS，CARO J，HALDEMAN S.A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationaly[J].Spine J，2008，8（1）：8—20.

[2] 白躍宏，俞紅。腰椎間盤退變分子遺傳學研究進展及轉(zhuǎn)換醫(yī)學應用[J]；轉(zhuǎn)化醫(yī)學雜志 2012，10（1）：104-110.

[3] Li Gao-feng，Zhang Shao-kun；Research of cytokines and gene therapy for intervertebral disc degeneration[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering research，2009，2（13）：359-362.

[4]Zhao Jian，Jia Lian-Shun.Adenovirus-mediated TGF-B1 gene transfer to human degenerative lumbar intervertebral disc cells[J].Chinese Medical Journal 2002；115（3）：409-412.

[5]Pfirrmann CW，M etzdorf A ，Zanetti M， et a1 . Magnetic resonance.classification of lumbar intervertebral disc degeneration [J ] .Spine ，200 1 ，26 （17 ） ：1873 —1 878 .

[6]Yanagita M. Inhibitors/antagonists of TFG-β system in kidney fibrosis[J].Nephrol Dial Transplant，2012，27（10）：3686-3691

[7]Bi Y，Gao B，Patel A.Patel A Evidence—based medication use among Chinese patients with acute coronary syndromes at the time of hospital discharge and 1 year after hospitalalization：results from the Clinical Pathnays for Acute Coronary Syndromes in China（CPACS）study 2009[J].JAMA，2009，313（10）：2015-2020

[8]李永民，趙靜等，NF-kB、TGF-B1在退變椎間盤組織中的表達及意義.[J]山東醫(yī)藥，2007，47（29）：13-14.