劉寧 王珍惜等

【摘要】單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在病原學(xué)上作為一種人畜共患和食源性疾病的致病菌已得到世界范圍普遍的公認(rèn)。近年來(lái)，如何分離和鑒定食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌已成為研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合近十年的各種該病菌的快速檢測(cè)方法作了系統(tǒng)綜述，介紹了針對(duì)該病菌的快速檢測(cè)方法， 如顯色培養(yǎng)基快速檢測(cè)方法、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測(cè)方法、結(jié)合單克隆抗體技術(shù)的免疫學(xué)檢測(cè)方法、反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)方法、生物芯片，以期對(duì)食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)起到幫助和指導(dǎo)作用。

【關(guān)鍵詞】單核增生細(xì)胞李斯特氏菌；檢測(cè)方法

【中圖分類號(hào)】R741.32 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）03-0234-02

基金項(xiàng)目： 2014年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號(hào)：201410313027）；2014年江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：201410313027Z）；

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種短小的革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌[1]，它能引起人畜的李氏菌的病，該病發(fā)病率較低，但致死率高達(dá) 20%～30%[2]，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，食品中存在的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。本文擬對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)方法及其當(dāng)前存在的問(wèn)題等作系統(tǒng)介紹，以期為進(jìn)一步深入研究提供參考。

1快速檢測(cè)方法

1.1 顯色培養(yǎng)基快速檢測(cè)方法

顯色或熒光鑒別培養(yǎng)基的基本原理是針對(duì)李斯特氏菌的β-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PI-PLC酶，設(shè)計(jì)相應(yīng)的底物，加入到常規(guī)選擇性培養(yǎng)基中，利用酶對(duì)底物的分解，產(chǎn)生熒光或顯色物質(zhì)，使其菌落形態(tài)或顏色不同于其他李斯特氏菌和非李斯特氏菌，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)李斯特氏菌快速定性鑒定和菌落數(shù)目快速定量。張淑紅等[3]檢測(cè)了顯色培養(yǎng)基的特異性和靈敏度。實(shí)驗(yàn)證明此種檢測(cè)方法具有較高靈敏度、特異性和選擇性，是非常有價(jià)值的分離平板。

1.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測(cè)方法（ELISA）

早期起初人們采用簡(jiǎn)單直接的細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用細(xì)胞計(jì)量術(shù)對(duì)牛奶中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行檢測(cè)。但是由于病原微生物的含量很低，僅通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)靈敏度無(wú)法達(dá)到。之后，基于抗原抗體的ELISA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)中，用酶聯(lián)熒光的方法檢測(cè)食品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。ELISA的方法雖然靈敏度較細(xì)胞計(jì)數(shù)方法有很大的提高，但是由于ELISA檢測(cè)的結(jié)果容易受多種因素影響，并且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，所以不能滿足檢測(cè)的要求。

1.2.2 結(jié)合單克隆抗體技術(shù)的免疫學(xué)檢測(cè)方法

針對(duì)和學(xué)習(xí)前人的科學(xué)成果，人們?cè)贓LISA的基礎(chǔ)上結(jié)合單克隆抗體技術(shù)建立了一種快速檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法[4]。建立了以高度特異的針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌和無(wú)害單增生李斯特氏菌的共同表位的單抗構(gòu)建的快速酶免疫檢測(cè)方法以及以抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的特異單抗為試劑所建立的快速檢測(cè)方法[5]。國(guó)內(nèi)焦新安等制備了針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性單抗并研制了檢測(cè)該菌的ELISA檢測(cè)試劑盒，推動(dòng)了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法的發(fā)展。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)方法

在PCR反應(yīng)中，死細(xì)胞的存在使得DNA擴(kuò)增數(shù)要大大降低，從而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)避免假陽(yáng)性至關(guān)重要。反轉(zhuǎn)錄-PCR把mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)特異引物擴(kuò)增目標(biāo)cDNA進(jìn)行PCR，因其具有高度敏感性，被應(yīng)用于檢測(cè)具有活性的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。采用反轉(zhuǎn)錄-PCR的檢測(cè)結(jié)果與一般PCR的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，但其反轉(zhuǎn)錄-PCR卻有效地檢測(cè)到單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌。李曉紅等[6]利用反轉(zhuǎn)錄-PCR方法對(duì)出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)傳統(tǒng)檢測(cè)方法確證，符合率達(dá)到100%，靈敏度高。

1.4 生物芯片

生物芯片是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，它主要通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)，使樣品檢測(cè)、分析過(guò)程連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，它為食源性疾病快速檢測(cè)提供了良好的發(fā)展空間。王剛等正用含有小牛血清BSA（減少對(duì)其它菌的非特異性吸收）的SiO2包被的蛋白芯片對(duì)C11EG抗體（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌一種IgG抗體）進(jìn)行研究[7]。目前，應(yīng)用于食品中致病菌檢測(cè)的生物芯片技術(shù)還在研究中，但我們相信建立、應(yīng)用生物芯片技術(shù)將成為食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法的一個(gè)發(fā)展方向。

2. 展望

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是WHO關(guān)注的食源性致病菌之一，也是我國(guó)食品污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)中檢測(cè)的重要食源性致病菌之一。隨著多學(xué)科的交叉，食源性致病菌的檢測(cè)一方面向綜合的方向發(fā)展，即集多種檢測(cè)技術(shù)于一體的多功能、全自動(dòng)化大型檢測(cè)儀器不斷出現(xiàn)；另一方面，針對(duì)單個(gè)菌種和菌屬的新型培養(yǎng)基、免疫試劑盒和分子試劑盒也會(huì)不斷推向市場(chǎng)。無(wú)論是從哪個(gè)角度，未來(lái)檢測(cè)的方向都是向著敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短的檢測(cè)方法的方向發(fā)展。相信隨著對(duì)李斯特氏菌的全方位深入了解和認(rèn)識(shí)，更方便快捷的檢測(cè)工具會(huì)不斷出現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳清平， 李善志， 張菊梅， 等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2005， 15（7）： 888-890.

[2] 沈曉盛， 鄭國(guó)興， 李慶， 等. 食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的危害及其檢測(cè)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2004， 30（8）： 87-91.

[3] 張淑紅， 吳清平， 張菊梅. 顯色培養(yǎng)基在單核細(xì)胞增生李斯特菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2007， 17（1）： 43-45.

[4] 梁銳萍， 黃素珍， 胡慧強(qiáng). 單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌及其檢驗(yàn)[J]. 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)， 2004， 21（11）： 47-49.

[5] 焦新安， 劉秀梵. 李斯特氏菌快速檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 肉品衛(wèi)生， 1996， 11（1）： 28-31.

[6] 李曉紅， 蔣琴娣， 吳仲梁， 等. 利用反轉(zhuǎn)錄-PCR方法快速檢測(cè)食品中單增李斯特菌[J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué)， 2003， 13（6）： 20-22.

[7] 王剛， 邱陽(yáng). 單核細(xì)胞增生李斯特菌及其快速檢測(cè)[J]. 微生物學(xué)雜志， 2011， 21（1）： 52-53.