李德英 李娜

摘要 [目的]GCMS分析致香真菌香氣成分。[方法]用頂空液相微萃取法（HLSM）和有機溶劑萃取法對一株致香真菌產(chǎn)生的香氣進(jìn)行萃取分析。[結(jié)果]頂空液相微萃取法，萃取劑甲醇的效果好，最適萃取體積為3 μl，萃取時間為5 min。其中烴類有8種，含量占總量的8.03%;醇類有2種，含量占總量的0.03%;酯類有5種，含量占總量的7.95%;酮類為3種，含量占總量的0.81%;酸類有2種，含量占總量的0.11%。有機溶劑萃取法，萃取劑乙醚的萃取效果好，其中烴類有20種，含量占總量的56.20%;酸類3種，含量占總量的307%;酯類7種，含量占總量的21.27%;醇類2種，含量占總量的1.62%;酮類有1種，含量占總量的0.51%。[結(jié)論]對該致香真菌香氣成分的分析可為其應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 香氣成分;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;致香真菌;頂空液相萃取法

中圖分類號 S182;Q935 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-217-03

GCMS Analysis of the Aroma Compounds Produced by an Aroma Fungi

LI Deying， LI Na

（The Ecological Environment Engineering College， Qinghai University， Xining， Qinghai 810016）

Abstract [Objective] The aroma compounds produced by a fungi were analyzed by GCMS. [Method] Two methods for extracting sweet smelling substance of an aroma fungi by HeadSpace LiquidPhase Microextraction （HSLM） and Solvent Extraction. GCMS was used in the research. [Result] The method of HSLM， better extractant was methanol， extractant volume was 3 μl， time was 5 minutes. Volatile compounds were hydrocarbon （8 kinds， taking up relative content 8.03%）， alcohol （2 kinds， taking up relative content 0.03%）， esters （5 kinds， taking up relative content 7.95%）， ketones （3 kinds， taking up relative content 0.81%）， and acids （2 kinds， taking up relative content 0.11%）. The method of Solvent Extraction， better extractant was ether. Volatile compounds were hydrocarbon （20 kinds， taking up relative content 56.20%）， alcohol （2 kinds， taking up relative content 1.62%）， esters （7 kinds， taking up relative content 21.27%）， ketones （1 kinds， taking up relative content 0.51%）， and acids （3 kinds， taking up relative content 3.07%）. [Conclusion] Analysis of aroma components of the aroma fungi laid the foundation for study and development of natural perfume.

Key words Aroma components; GCMS; Aroma fungi; Headspace liquidphase microextraction

基金項目 青海大學(xué)中青年基金團(tuán)隊項目（2012QNT7）。

作者簡介 李德英（1982- ），女，青海西寧人，講師，碩士，從事微生物學(xué)研究。

收稿日期 20141211

微生物因代謝產(chǎn)生不同氣味物質(zhì)而被人們所知，而這些氣味有些是人們喜歡的，而有些則是讓人們厭惡的。由于有些微生物有其特殊的氣味，而被廣泛用于食物和飲料中，如牛奶、奶酪、奶油、酒等^[1-2]。人們把能夠產(chǎn)生人們喜歡的氣味的微生物稱為致香微生物或致香菌。利用微生物生成有香氣的物質(zhì)或者是通過微生物的作用轉(zhuǎn)換成與香料關(guān)聯(lián)的物質(zhì)的嘗試已正在進(jìn)行^[3]。Y.Wache發(fā)現(xiàn)，某些酵母菌能產(chǎn)生香味物質(zhì)而且已將這些香味物質(zhì)用于生產(chǎn)香水和香味調(diào)料等領(lǐng)域^[4]。日本研究并已應(yīng)用的從耐左旋刀豆氨酸變異菌株中分離出的高產(chǎn)香酵母，生產(chǎn)出的清酒香味成分濃、風(fēng)味好。同時，日本在開發(fā)利用食用微生物香味劑這方面也有一定的發(fā)展^[5]。雖然，致香菌在一些領(lǐng)域中已經(jīng)得到了很好的應(yīng)用，但是其應(yīng)用領(lǐng)域仍可以進(jìn)一步拓寬^[6]。為了更好地利用致香微生物，人們開始研究各種致香微生物所產(chǎn)香氣的成分。目前對致香微生物香氣成分的分析已有報道[3，7-10]，但利用簡單方便的頂空液相萃取法（LPME）^[11]萃取致香微生物所產(chǎn)香氣并進(jìn)行萃取分析的較少，該方法是近年來在傳統(tǒng)的液-液萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的微型化的液相萃取技術(shù)，可以快速有效地萃取香氣。筆者采用頂空液相萃取法和有機溶劑萃取法對一株致香真菌香氣進(jìn)行萃取，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法進(jìn)行致香真菌香氣成分分析，以期為該致香真菌的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。

供試菌種由青海大學(xué)微生物實驗室分離純化。

1.1.2 培養(yǎng)基。

蛋白胨2 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01 g/L，葡萄糖30 g/L，麩皮3 g/L，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器。

立式電動電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX40Ⅱ），超凈工作臺，智能光照培養(yǎng)箱（GXZ），電子秤（XS.225ASCS），恒溫振蕩器（HZQC），離心機，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（TRACE DSQⅡ，美國Thremo Fisher公司）。

1.1.4 主要試劑。

蛋白胨、K₂HPO₄、KCl、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O、葡萄糖、甲醇、丙酮、正辛醇、正己烷、環(huán)己烷、四氯化碳、乙醚、甲酸乙酯，均為分析純。

1.2 方法

液體發(fā)酵培養(yǎng)：定量將菌株接種到裝有100 ml液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在搖床上以25 ℃，120 r/min的條件培養(yǎng)3 d，進(jìn)行香氣的萃取分析。

1.2.1 頂空液相萃取法。

用微量進(jìn)樣器吸取一定量的有機溶劑萃取劑，垂直插入樣品瓶中，使針尖位于樣品液（液體發(fā)酵液）液面上一定距離處，將微量進(jìn)樣器內(nèi)的有機溶劑慢慢推出，使之懸掛在進(jìn)樣器的針尖上，萃取一定時間后，慢慢將懸掛的萃取劑抽回到進(jìn)樣器，再將進(jìn)樣器從樣品瓶中抽出，直接進(jìn)樣到氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行分析。

該試驗對萃取劑的種類、萃取劑的體積以及萃取時間進(jìn)行了比較分析。

1.2.2 有機溶劑萃取法。

將發(fā)酵液以4 000 r/min離心10 min，收集上清液。在上清液中加入等體積的有機溶劑萃取6 h，取有機相1 μl，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

1.2.3 香氣的分析。

使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對致香真菌香氣成分進(jìn)行分析。

色譜條件：GSBP5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;載氣為氦氣，流速1 ml/min;進(jìn)樣口溫度240 ℃;升溫程序為50 ℃保持1 min，以8 ℃/min的升溫速度升至260 ℃，保持5 min;連接桿溫度260 ℃。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度250 ℃。

譜庫：NIST05。

使用面積歸一化法進(jìn)行相對定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空液相萃取

2.1.1 萃取劑的選擇。

試驗選取甲醇、丙酮、正辛醇、正己烷、環(huán)己烷、四氯化碳作為萃取劑。結(jié)果表明，丙酮、正己烷、環(huán)己烷、四氯化碳的揮發(fā)性較強，在未到萃取時間萃取劑已揮發(fā)完，不宜選作萃取劑;甲醇和正辛醇初步選為萃取劑。將甲醇和正辛醇的萃取結(jié)果進(jìn)行GCMS分析，甲醇作為萃取劑的樣品分析出20種，而正辛醇的分析出15種，故甲醇萃取效果好。因此，用于頂空液相萃取的最佳萃取劑為甲醇。

2.1.2 萃取劑的體積。

萃取劑的體積會直接影響目標(biāo)物的萃取量。試驗表明，萃取劑一般都具有揮發(fā)性，萃取劑體積過?。?、2 μl），目標(biāo)物的萃取量有限;萃取劑體積過大（4 μl），微量進(jìn)樣器的針尖上懸掛不住。因此，最適當(dāng)?shù)妮腿◇w積為3 μl。

2.1.3 萃取時間。

萃取劑一般都具有揮發(fā)性，萃取時間過長，萃取劑的揮發(fā)會影響目標(biāo)物的萃取量;如果萃取時間過短，萃取不夠充分，同樣會影響目標(biāo)物的萃取量。試驗表明，5 min為最適的萃取時間。

2.1.4 頂空液相萃取香氣成分GCMS分析。

使用頂空液相萃取法時，根據(jù)NIST05譜庫，并結(jié)合人工解析，檢出并鑒定出20種化合物，其分析結(jié)果如表1。

表1 頂空液相萃取香氣成分分析結(jié)果

序號保留時間∥min化合物中文名稱化合物英文名稱相對含量∥%

13.063甲基1丁醇1Butanol，3methyl0.01

23.39乙酸2甲基丙酯Acetic acid，2methylpropyl ester0.26

33.96N癸酸nDecanoic acid0.02

44.733甲基1丁醇-乙酯3methyl1butanolethyl0.20

55.00乙酸（2，4，5三氯苯氧基）- 異辛酯Aceticacid，（2，4，5trichlorophenoxy），isooctyl ester0.01

66.48薄荷醇Menthol0.02

76.91萘Naphthalene0.08

87.24丙酸Propanoic acid0.09

98.18四烷Tetracosane0.01

1010.171甲基萘，Naphthalene，1methyl0.22

1111.011，2，3，7，8五氯二苯并呋喃1，2，3，7，8Pentachlorodibenzofuran0.26

1214.451（2，4，6三甲苯）-乙酮1（2，4，6trimethylphenyl）Ethanone0.02

1314.902，5環(huán)己二烯1，4二酮2，5Cyclohexadiene1，4dione，0.61

1416.31鄰苯二甲酸二乙酯Diethyl Phthalate6.32

1517.472，6二甲基萘Naphthalene，2，6dimethyl0.04

1617.772，7二甲基萘Naphthalene，2，7dimethy0.04

1718.452，6雙（1，1二甲基）-環(huán)己二烯1，4二酮Cyclohexadiene1，4dione，2，6b is（1，1dimethylethyl）0.18

1819.87四乙基錫烷Stannane，tetraethyl0.06

1922.70硫氰酸甲酯Thiocyanic acid，methyl ester1.16

2026.78二十七烷Heptacosane7.32

由表1可看出，致香真菌香氣成分中，烴類有8種，含量占總量的8.03%;酯類有5種，含量占總量的7.95%;酮類為3種，含量占總量的0.81%;醇類有2種，含量占總量的003%;酸類有2種，含量占總量的0.11%。

2.2 有機溶劑萃取法

采用甲酸乙酯和乙醚作為有機溶劑萃取劑，甲酸乙酯作為萃取劑檢出并鑒定出21種香氣成分，乙醚作為萃取劑檢出并鑒定出33種香氣成分，故乙醚的萃取效果好。乙醚為萃取劑時，其分析結(jié)果如表2。

由表2可以看出，致香真菌香氣成分中，烴類有20種，含量占總量的56.20%;酯類7種，含量占總量的21.27%;酸類3種，含量占總量的3.07%;醇類2種，含量占總量的162%;酮類有1種，含量占總量的0.51%。

3 討論

該研究采用不同的萃取方法，香氣成分分析的結(jié)果顯示其分析出的成分有烴類、酯類、酸類、醇類與酮類。在整個香氣成分萃取過程中，運用了頂空液相萃取法和有機溶劑萃取法，但是經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，二者的分析結(jié)果有差異，其共同成分很少?？赡艿脑蚴?種方法萃取的位置不同，頂空液相萃取是采用萃取劑對菌體產(chǎn)生的香氣進(jìn)行頂空萃取，而有機溶劑萃取是采用有機溶劑對菌體發(fā)酵液離心后萃取，由于香氣物質(zhì)揮發(fā)性的差異，導(dǎo)致2種方法萃取結(jié)果的差異。因此，對致香真菌香氣成分分析時要結(jié)合2種方法進(jìn)行綜合分析。供試菌株發(fā)酵液果香味濃香，產(chǎn)酯種類較多，可嘗試用作香精和香料的提取等應(yīng)用。同時青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院實驗室從青海湖中和腐爛荸薺各分離出一株產(chǎn)鳳梨味真菌，后經(jīng)鑒定為同種（另文發(fā)表）。

表2 有機溶劑萃取香氣成分分析結(jié)果

序號保留時間∥min化合物中文名稱化合物英文名稱相對含量∥%

13.33N，N二甲基-甲酰胺Formamide，N，Ndimethyl1.20

24.96N棕櫚酸nHexadecanoic acid2.75

35.00[1，1′2環(huán)氧丙基]2辛酸，2′己基甲基酯[1，1′bicyclopropyl]2octanoic acid，2′hexylmethyl ester1.07

45.75辛酸甲酯Octanoic acid，methyl ester0.04

56.461十四醇1Tetradecanol1.01

67.01丙酸Propanoic acid0.07

77.699硬脂酸（z）甲酯9Octadecenoic acid（Z），methyl ester0.38

88.38苯乙醇Phenylethyl Alcohol0.61

98.83癸二酸甲酯Decanoic acid，methyl ester0.44

109.56N癸酸nDecanoic acid0.15

1110.50十七烷Heptadecane0.19

1211.091甲基萘Naphthalene，1methyl0.38

1311.38棕櫚酸甲酯Hexadecanoic acid，methyl ester0.37

1411.82二十七烷Heptacosane0.46

1512.662十三烷酮2Tridecanone0.51

1613.86十九烷Nonadecane0.68

1714.55十五烷Pentadecane1.03

1814.802，4二（1，1二甲基）-苯酚Phenol，2，4bis（1，1dimethylethyl）1.07

1916.332，6，11三甲基十二烷dodecane2，6，11trimelthy2.08

2016.35十六烷Hexadecane2.09

2118.422，62異丙基萘2，62 isopropyl naphthalene4.57

2217.792（1甲基）-萘Naphthalene，2（1methylethyl4.77

2318.472，3，6三甲基-萘Naphthalene，2，3，6trimethyl5.64

2418.89二十烷Eicosane1.26

2519.46二十八烷Octacosane3.20

2620.85十八烷Octadecane3.22

2721.71鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate4.72

2822.60二十五烷Pentacosane5.24

2923.38二十一烷Heneicosane5.64

3024.53十四烷Tetradecane4.45

3125.85酚1，3甲基5（1甲基乙基）- 氨基甲酸酯Phenol，3methyl5（1methylethyl），methylcarbamate14.25

3226.67二十六烷Hexacosane7.34

3328.16N，N二乙基1，4苯二胺1，4Benzenediamine，N，Ndiethyl3.18

43卷3期 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 李德英等 一株致香真菌香氣成分的GCMS分析

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