馬書(shū)梅

【摘要】 目的 檢測(cè)MMP-2在新生小鼠模型中的表達(dá)，探討MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病過(guò)程中的作用。方法 將7 日齡C57BL/6J小鼠置于75%plusmn；2%高氧環(huán)境中，5 天后再置于正?？諝猸h(huán)境中，建立高氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的小鼠模型。于鼠齡17 天時(shí)處死動(dòng)物并摘除眼球，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中MMP-2的表達(dá)情況。結(jié)果 MMP-2在對(duì)照組和高氧組的積分光密度值分別為16.33plusmn；4.13和21.12plusmn；6.29，兩者比較有顯著性差異（t=3.160，Plt；0.01）。結(jié)論 MMP-2可能對(duì)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的新生血管生成有一定作用。

【關(guān)鍵詞】 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變；MMP-2；視網(wǎng)膜新生血管

【中圖分類(lèi)號(hào)】R774.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）02-0086-03

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（Retinopathy of prematurity，ROP）是發(fā)生于早產(chǎn)和低體重兒的一種致盲性視網(wǎng)膜病變，其病理特征為視網(wǎng)膜血管異常增生，嚴(yán)重者可引起玻璃體出血、視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離等多種并發(fā)癥。上世紀(jì)80年代以來(lái)，由于醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，早產(chǎn)兒的成活率也顯著提高，ROP的發(fā)病率也隨之呈上升趨勢(shì)，在體重低于1 000 g的超低體重兒，發(fā)病率高達(dá)80%以上[1，2]。目前，ROP已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)兒童致盲的重要原因，約占兒童致盲原因的6%～18%[3]。防治ROP以改善早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量己成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。己經(jīng)明確ROP與吸氧治療高度相關(guān)，早產(chǎn)、高氧和低出生體重是發(fā)病過(guò)程中最為關(guān)鍵的因素，但其發(fā)病的確切機(jī)制至今仍不明確。

研究表明，視網(wǎng)膜新生血管形成在ROP的發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用。盡管近年來(lái)人們對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的認(rèn)識(shí)研究有了不少突破，但由于其確切發(fā)病機(jī)制仍然不明，目前臨床上尚無(wú)完全根治性手段。在對(duì)視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生機(jī)制的研究中，諸多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)發(fā)揮的作用一直是關(guān)注的重點(diǎn)。近些年來(lái)，對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的研究成為熱點(diǎn)。

本研究在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的小鼠模型中，應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)了基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達(dá)，進(jìn)一步探討MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康的清潔級(jí)C57BL/6J幼鼠（與哺乳母鼠在一起），選擇鼠齡7 天的共40 只，雌雄兼有。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

MMP-2免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變小鼠模型的建立

選擇鼠齡7天的健康清潔級(jí)C57BL/6J幼鼠40 只，與哺乳母鼠在一起，雌雄兼有，隨機(jī)分成2組，高氧組20 只，對(duì)照組20 只。對(duì)照組在正常環(huán)境溫度下飼養(yǎng)；高氧組置于密閉有機(jī)玻璃容器內(nèi)。容器內(nèi)接入100%濕潤(rùn)醫(yī)用純氧氣，使容器內(nèi)氧分壓保持在75 %plusmn；2 %，并用測(cè)氧儀全程監(jiān)測(cè)容器內(nèi)的氧分壓，確保氧濃度的恒定。高氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，然后移置正常環(huán)境溫度中飼養(yǎng)。每天日光照明12小時(shí)，環(huán)境溫度控制在（23plusmn；2）℃。每日打開(kāi)氧箱更換墊料、加食、替換母鼠1次。

1.4 標(biāo)本的制備

鼠齡17 天時(shí)處死幼鼠，將眼球摘除，浸泡于4 %多聚甲醛中性緩沖液中固定24 小時(shí)，保存溫度為4 ℃。梯度酒精脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。標(biāo)記方向，制作切片時(shí)應(yīng)避開(kāi)視乳頭周?chē)?，含有視神?jīng)的切片應(yīng)排除在外。連續(xù)切片，厚度6 mu；m，切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位平面。

1.5 免疫組化法

按照即用型SABC免疫組化試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：石蠟切片置于60 ℃烘箱2～3小時(shí)溶解石蠟，二甲苯常規(guī)脫蠟至水，0.3%過(guò)氧化氫室溫孵育5～10 分鐘，切片置于抗原修復(fù)液中92～98 ℃水浴10 min，室溫中冷卻20 min。滴加5%BSA封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（1：150），4 ℃過(guò)夜。次日滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，置濕盒內(nèi)37 ℃，滴加試劑SABC，室溫孵育30 min。DAB顯色：使用DAB顯色劑試劑盒，取蒸餾水1 mL，加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后加至切片，室溫避光10 min。蘇木素復(fù)染1 min，脫水、透明、封片、鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)plusmn；標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 11.5 for windows 進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，以Plt；0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。