王淼等

摘要

[目的]構建FMDV乳酸桿菌穿梭表達載體。[方法]從A型FMDV中克隆出VP1基因后，根據(jù)乳酸桿菌密碼子偏好性對VP1進行優(yōu)化，與表達載體pSIP411進行連接，并將連接產(chǎn)物轉化到DH5α中篩選出陽性克隆菌，重組質粒酶切和PCR鑒定成功后再轉化到BL21中，采用桿菌肽進行誘導表達。[結果]表達產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE和Western blottmy 檢測在24 kD處有明顯的條帶，證明VP1pSIP411重組表達載體構建成功并在BL21中成功表達。[結論]為后續(xù)乳酸桿菌表達VP1蛋白研究奠定了基礎。

關鍵詞口蹄疫病毒；VP1；pSIP；乳酸菌；大腸桿菌

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）21-025-03

口蹄疫（FootandMouth Disease，F(xiàn)MD）是一種高度傳染性和經(jīng)濟破壞性的家畜疫病，能夠引起家畜生產(chǎn)性能降低，患病仔畜高死亡率，對畜牧行業(yè)造成巨大損失。除對動物貿(mào)易的擾動外，F(xiàn)MD的暴發(fā)還會造成嚴重的經(jīng)濟和社會影響，包括對飼料行業(yè)、獸藥行業(yè)和旅游相關產(chǎn)業(yè)的破壞。尤其重要的是，它制約了發(fā)展中國家的畜牧業(yè)發(fā)展，特別對無FMD病原的國家和地區(qū)能夠造成巨大的經(jīng)濟損失。如2001年荷蘭和英國、2007年英國暴發(fā)的FMD造成的慘重損失[1]。

FMD的病原是口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus， FMDV），是單鏈正義RNA病毒，屬于微小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。病毒基因組全長約 8.5 kb，有 7 個血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亞洲1型），型間無交叉保護。其開放閱讀框由 L 基因、P1 結構蛋白基因（包括VP4、VP2、VP3、VP1基因）、P2非結構蛋白基因（包括2A、2B、2C基因）和P3非結構蛋白基因（3A、3B、3C、3D基因）組成。其中，VP1蛋白帶有誘導FMD免疫反應的關鍵表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸。VP1基因全長636 nt，是編碼FMDVVP1蛋白的免疫原性基因。圍繞VP1分子，目前研究較熱的FMD基因工程疫苗包括亞單位疫苗、可飼疫苗、蛋白質載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗和核酸疫苗等[2-3]。

pSIP表達系統(tǒng)是目前研究最為深入、機理最為清楚、使用最為廣泛的乳酸菌表達系統(tǒng)之一，能很好地表達外源性抗原，且以乳酸桿菌作為外源保護性抗原基因的受體菌株，可將乳酸菌的益生作用和表達外源功能抗原基因的特異性免疫功能相結合，最大程度地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[4]。因此，構建重組FMDV VP1基因乳酸桿菌表達載體，是研究乳酸桿菌活載體疫苗的前體和保障。該試驗旨在為后續(xù)乳酸桿菌表達VP1蛋白研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1毒株、菌株和載體

乳酸桿菌穿梭表達質粒pSIP411由挪威Nofima研究所的Lars Axelsson教授惠贈，大腸桿菌DH5α和BL21購自于TaKaRa公司，A型FMDV和豬FMDV陽性血清為中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所國家口蹄疫參考實驗室保存。

1.2主要試劑

T4 DNA連接酶、Nco I限制性內(nèi)切酶、Xho I 限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；Ex Taq DNA 聚合酶、DNA marker購自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；紅霉素購自amresco公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自Millipore公司；HRP標記山羊抗豬IgG抗體購自美國Abbkine公司；預染蛋白質分子量標準購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；革蘭氏陽性菌質粒提取試劑盒購自北京索萊寶公司；革蘭氏陰性菌質粒提取試劑盒購自上海捷瑞公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1

A型FMDV總RNA提取。 取于-70 ℃保存的豬水泡皮毒0.1 g，無菌條件下置于研缽中剪碎，加入適量石英砂后邊研磨邊加DMEM細胞培養(yǎng)液，研磨至無肉眼可見組織塊時加雙抗，收集后于4 ℃冰箱過夜。取上清后，按照Qiagen RNeasy Mini Kit （50） 說明書進行總RNA提取。相關器皿經(jīng)高溫烘烤，試劑、耗材均使用無RNase產(chǎn)品。

1.3.2

cDNA合成及A型FMDV VP1基因的擴增。通過比對NCBI上已經(jīng)收錄的A型FMDV VP1基因，利用軟件Primer 5.0設計特異性引物。

VP1F： 5′GACATGTCCTCCTGCATCT3′；

VP1R： 5′CACAAATGTACAGGGATGGGT3′。

采用TaKaRa PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2.0 進行反轉錄和擴增VP1基因，按照表1程序進行。

利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術有限公司進行測序。

1.3.3

A型FMDV VP1基因序列分析。用DNA Star軟件的MegAlign對VP1基因進行測序，測序結果與GenBank中的參考序列進行同源性比對。

1.3.4

目的基因的設計與合成。根據(jù)乳酸菌密碼子偏好對VP1進行優(yōu)化，改造后序列由南京金斯瑞生物技術有限公司合成，并克隆到載體pUC57上。并在目的序列兩側加入限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI的酶切位點。

1.3.5

重組表達載體的構建。將人工合成的含有pUC57VP1的大腸桿菌DH5α涂布于LB固體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素）上進行分離培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)過夜。12 h后挑取單個菌落，于5 ml液體LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)10～14 h。按照捷瑞公司革蘭氏陰性菌質粒小提試劑盒說明書進行操作。

將含有pSIP411陽性質粒的乳酸球菌MG1363涂布于M17固體培養(yǎng)基（含有10 μg/ml Em）上，恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24～36 h。用無菌小槍頭挑取單個菌落轉接到5 ml M17液體培養(yǎng)基（含有10 μg/ml Em）中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。按照索萊寶公司革蘭氏陽性菌質粒小提試劑盒說明書進行操作。

采用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI分別對VP1和pSIP411表達載體進行雙酶切，37 ℃水浴5 h后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定成功之后膠回收，回收后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

將回收后的VP1基因和pSIP411載體片段用T4 DNA連接酶進行連接。將重組質粒導入DH5α中進行擴增，在LB平板上挑取疑似陽性重組克隆子，分別接種于5 ml含200 μg/ml紅霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。然后進行重組質粒提取，將可能的陽性重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定。

1.3.6

A型FMDV VP1基因在大腸桿菌BL21中的表達。

經(jīng)過雙酶切鑒定和PCR鑒定均為陽性的BL21陽性克隆子接種于5 ml （含200 μg/ml Em） LB液體培養(yǎng)基中，2 000 r/min 、37 ℃培養(yǎng)12 h，將上述菌液以1∶100的接種率接種于10 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD值為0.6～08，此時記為0 h誘導，在培養(yǎng)基中加入誘導物SppIP （100 ng/ml），之后每隔1 h取菌液至7 h。同樣誘導含有空載體pSIP411的BL21，以此作對照，分別取2 ml各個時間收集的誘導菌液，12 000 r/min離心10 min，棄去上清留菌體沉淀，進行SDSPAGE電泳。

1.3.7

Westernblotting分析。SDSPAGE凝膠電泳后，進行電轉。用PBS沖洗NC膜3次，然后將膜浸泡于含10%脫脂奶粉的PBST中，37 ℃搖動封閉2 h；封閉結束后PBST清洗NC膜3次，再加入1∶200稀釋的豬抗FMDV A型血清，37 ℃輕搖孵育1 h；取出后用PBST清洗3次，每次15 min；洗完后加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗豬IgG，37 ℃輕搖孵育1 h，PBST清洗3次，每次15 min。將膜取出后進行ECL顯色。

2 結果與分析

2.1VP1序列分析及密碼子優(yōu)化

用DNA Star軟件的MegAlign對VP1基因測序結果與GenBank中的參考序列進行同源性比對，結果顯示，該試驗所用VP1序列與參考序列（KF450794、HQ116363、HQ268510、HQ116298、EU667455、HQ116293、EU667458、KC588943和F792355）核苷酸一致性均大于91%，其中與2013年廣東茂名所分離的A型毒株核苷酸一致性達到99.5%（圖1）。

對野生型VP1基因進行密碼子優(yōu)化，調(diào)整的序列占原序列的66.04%，從而使G+C含量由59.53%降低到47.49%，212個密碼子中，改變140個密碼子，優(yōu)化密碼子占66.04%。

2.2重組表達質粒的鑒定

使用XhoI和NcoI對含有已優(yōu)化好VP1基因的重組質粒pUC57進行PCR鑒定和雙酶切鑒定。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR擴增片段和酶切片段與預期大小一致（圖2、3）。將已優(yōu)化的VP1與pSIP411載體16 ℃連接過夜后，分別轉化到大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細胞中，挑取的單個菌落提取質粒后進行PCR鑒定和雙酶切鑒定。通過電泳鑒定目的片段大小與預期結果相符（圖2）。

2.3重組大腸桿菌的SDSPAGE分析

將誘導的重組菌pSIP411VP1BL21和對照菌pSIP411BL21、未誘導的pSIP411VP1BL21處理進行SDSPAGE分析，結果表明，經(jīng)誘導的重組菌pSIP411VP1BL21在24 kD處有一條模糊的條帶，而對照菌pSIP411BL21和未誘導的pSIP411VP1BL21在24 kD處沒有條帶，說明重組菌pSIP411VP1BL21經(jīng)誘導后表達了目的蛋白，但表達量很低，利用SDSPAGE觀察效果不明顯，進一步采用Western blotting進行鑒定，結果見圖3。

2.4重組大腸桿菌的Western blotting結果鑒定

將誘導的重組菌pSIP411VP1BL21和對照菌pSIP411BL21、未誘導的pSIP411VP1BL21處理進行Western blotting分析，結果表明經(jīng)誘導的重組菌pSIP411VP1BL21在24 kD處有一條明顯的條帶，而對照菌pSIP411BL21和未誘導的pSIP411VP1BL21在24 kD處沒有條帶，說明重組菌pSIP411VP1BL21經(jīng)誘導后表達的目的蛋白具有反應原性（圖4）。

2.經(jīng)誘導的質粒pSIP411在BL21中的表達產(chǎn)物轉印結果；3.未經(jīng)誘導的重組質粒pSIP411VP1在BL21中的表達產(chǎn)物轉印結果。

3結論與討論

一直以來，F(xiàn)MD嚴重制約世界畜牧業(yè)的發(fā)展，尤其在FMD流行地區(qū)仍將傳統(tǒng)疫苗免疫作為防控的主要措施。隨著科學技術的進步，新型疫苗的研制也在迅猛發(fā)展，但仍處于試驗探索階段。將黏膜免疫應用在FMD疫苗的研究中也開始興起[5]。通過黏膜免疫途徑將表達出的FMD VP1與霍亂毒素b亞單位結合后免疫豬和小鼠，發(fā)現(xiàn)黏膜免疫能夠誘導產(chǎn)生IgA，以半數(shù)感染量的劑量對豬攻毒后，保護率可達80%[6]。以牛IL6基因作為黏膜分子佐劑，通過鼻免疫將制備好的吸附殼聚糖PLGA納米/微球載FMD DNA疫苗免疫豚鼠，保護率可達60%[7]。將構建好的吸附殼聚糖海藻糖載FMD滅活抗原納米微球和吸附殼聚糖載聚乳酸-羥基乙酸共聚物載FMD質粒納米微球分別鼻黏膜免疫牛，結果發(fā)現(xiàn)2種納米微球都能誘導局部的鼻黏膜免疫應答，且還能誘導機體產(chǎn)生系統(tǒng)性的體液免疫和細胞免疫應答[8]。特別是乳酸桿菌活載體疫苗的研究進入高速發(fā)展時期，多種表達系統(tǒng)被構建，多種外源蛋白及抗原被表達。相信不久的將來以乳酸桿菌為代表的黏膜免疫新型疫苗的研制會有質的突變，并將給FMD的防控帶來新的革命。

43卷21期王 淼等重組A型FMDV VP1基因乳酸桿菌穿梭表達質粒的構建及在大腸桿菌BL21中的表達

FMDV 的VP1基因編碼的蛋白帶有誘導FMD免疫反應的關鍵表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸，是編碼FMDVVP蛋白的免疫原性基因。其多肽序列上含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（ArgGlyAsp），即RGD序列，是病毒吸附宿主細胞所必須的氨基酸序列。通過基因工程表達出來VP1編碼的蛋白能夠誘導與感染性FMD病毒粒子相同的免疫作用。圍繞VP1分子，目前研究較熱的FMD基因工程疫苗包括亞單位疫苗、可飼疫苗、蛋白質載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗和核酸疫苗等。

抗原受體菌株有多種可以選擇，沙門氏菌、李氏桿菌等減毒細菌常被應用于遞呈抗原，但這些菌株卻有毒力返祖的潛在危險。而乳酸菌是人和動物腸道內(nèi)正常存在的菌群，抑制腐敗菌生長繁殖，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，對宿主免疫系統(tǒng)有很強的調(diào)節(jié)功能，進入宿主體內(nèi)能適應胃部酸性環(huán)境和耐受腸道內(nèi)各種消化酶，能很好地在腸道內(nèi)定植。質粒載體的作用是將目的DNA片段運送到受體細胞中，但如果質粒到達宿主洗白基因組內(nèi)，就會造成基因紊亂、表達失控、細胞轉型等不良后果。因此要選擇研究透徹的表達系統(tǒng)[4]。

該試驗所用的載體是研究和應用較多的pSIP411大腸

桿菌-乳酸桿菌穿梭表達載體。該研究構建的pSIP411VP1重組質粒在大腸桿菌BL21中進行表達，首要的原因是BL21是該載體的表達菌株，可以鑒定表達載體構建成功并測定是否具有表達功能，其次是因為該表達載體在大腸桿菌中的表達操作程序更容易，通過從BL21中提取出已鑒定表達成功的重組質粒導入到乳酸桿菌中進行表達，操作更具有目的性，為乳酸菌的表達進行了初步性探究，對重組大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭表達載體pSIP411VP1的表達效果進行初期驗證。該表達系統(tǒng)是乳酸菌表達系統(tǒng)，雖然不如大腸桿菌表達系統(tǒng)蛋白表達量高，但該系統(tǒng)誘導的是黏膜免疫，通過口服給藥，在腸道相關淋巴組織處被M細胞遞呈抗原或直接被抗原遞呈細胞遞呈，產(chǎn)生的是級聯(lián)反應，很少的抗原量就可激發(fā)機體較強的免疫應答。

參考文獻

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