朱崎 歐瑜 李杰通

摘要：目的： 將p16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移胃癌細胞株MKN-28中，觀察轉(zhuǎn)染前以及轉(zhuǎn)染后p16基因?qū)ξ赴┘毎忠u轉(zhuǎn)移能力與運動能力的影響。在基因的水平探討p16基因?qū)τ谖赴┘毎D(zhuǎn)移的抑制機制。方法： 通過脂質(zhì)體傳染法順利的將p16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MKN-28細胞株中，根據(jù)Transwell小室測定法測定細胞穿膜侵襲的能力，利用SDS-PAM凝膠電泳法檢測明膠酶的活性。結(jié)果： 在經(jīng)過p16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，根據(jù)顯微鏡下的計數(shù)顯示，胃癌細胞能夠穿透基底膜的數(shù)量與轉(zhuǎn)染前相比具有明顯的減少（p<0.05），具有統(tǒng)計學意義。細胞的運動能力也是差與轉(zhuǎn)染前。PAM凝膠電泳顯示負染帶的寬度有明顯的變窄，降解基質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移能力明顯下降。結(jié)論： p16基因抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移可能是通過對癌細胞的侵襲和運動能力的控制得以實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：p16基因；胃癌細胞；癌細胞轉(zhuǎn)移

資助項目：湖南省教育廳科技計劃項目（13C963）

胃癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，它嚴重危害著人們的身心健康，在全球腫瘤發(fā)病率以及死亡率中位居第2，給胃癌患者帶來了很大的身體危害及心理壓力[1]。并且目前胃癌的發(fā)病率在國內(nèi)外均呈顯著上升的趨勢。臨床醫(yī)學上對于胃癌的治療也是較為吸引人們的注目，目前利用腫瘤抑制基因?qū)Π┘毎霓D(zhuǎn)移進行抑制成為研究的熱點[2]。故本次研究利用p16轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移胃癌細胞株MKN-28，研究轉(zhuǎn)染前后p16基因?qū)τ谖赴┘毎D(zhuǎn)移以及運動的能力的影響，旨在尋求一種能夠為以后利用該基因進行癌癥治療的時候提供實驗以及理論上的依據(jù)。

注：P值表示MKN-28與P16- MKN-28組間比較的結(jié)果。

1材料與方法

1.1主要試劑

P16重組質(zhì)粒由本室進行構(gòu)建，脂質(zhì)體買自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒買自TaKaRa公司，RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品。G418及丙烯酰胺凝膠電泳試劑買自Sigma公司，Transwell細胞培養(yǎng)小室為Costor產(chǎn)品，纖維黏連蛋白和ECL試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2細胞培養(yǎng)與處理

胃癌細胞株MKN-28接種于RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、含有50ml/LCO2 的濕潤空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。按照1×105/孔的細胞密度進行接種，并使用無血清培養(yǎng)液進行清洗。將脂質(zhì)體稀釋與無血清培養(yǎng)液中制備成混合溶液A。另將p16以及空白質(zhì)粒稀釋成B1和B2。然后將A與B溶液分別進行混合，并置室溫放置20分鐘。然后滴加混合液和無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)一定時間之后，換為G418完全培養(yǎng)液，然后篩選，擴大培養(yǎng)。設(shè)轉(zhuǎn)染前胃癌細胞為空白對照組，而轉(zhuǎn)染后為陰性對照組。

1.3細胞運動能力的測定

將實驗用品先進行預(yù)冷處理，在室膜表面加入膠體，此時要注意涂抹要均勻，然后對著燈光輕輕拍打均勻。然后將其放在培養(yǎng)液中水化，然后在外膜上涂上纖維黏連蛋白，干燥。最后一定濃度的細胞放置于Transwell小室中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10-60h，每10h小時為觀察點。具體的觀察方法為：將樣品取出小室，用棉簽擦去上室中的細胞，并用蘇木素伊紅染色，用樹脂膠將其封片。400倍顯微鏡下在上下左右中五個不同的視野內(nèi)將侵襲細胞進行計數(shù)，取平均。

1.4Western blot

將轉(zhuǎn)染前后胃癌細胞置于細胞裂解液中，離心分離收集。配置一定含量的分離膠和濃縮膠，將樣品與緩沖液等體積進行混合，并用蛋白質(zhì)對參照物進行標記。電泳后使用清水以及緩沖液進行清洗，利用電轉(zhuǎn)移法進行轉(zhuǎn)膜。然后清洗干燥，加脫脂粉后封閉過夜。ECL試劑盒內(nèi)的溶液等體積混合后滴加到膜上，溫室孵育后用X線進行膠片曝光[2]。

1.5明膠酶活性檢測

將細胞進行接種后，進行培養(yǎng)，然后離心分離去除細胞碎片，然后取長層液加入緩沖液后進行點樣。電泳結(jié)束后，浸入孵育液中進行孵育，然后使用考馬斯亮藍進行染色，然后使用脫色液進行脫色，指導(dǎo)顯示出白色條帶為止。清洗觀察。

1.6統(tǒng)計學分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示， P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染前后MKN-28胃癌細胞中p16蛋白的表達

進行轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p16的實驗組中在明確的蛋白位置出現(xiàn)p16的特異性目的蛋白質(zhì)條帶，但是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)染前并沒有出現(xiàn)這中特異性條帶。

2.2轉(zhuǎn)染前后MKN-28胃癌細胞的穿膜能力

顯微鏡下的細胞計數(shù)顯示，隨著實驗時間的不斷增長，具有侵襲能力的細胞數(shù)量呈增加的趨勢。轉(zhuǎn)染后胃癌細胞穿透基底膜的數(shù)量與為傳染相比有很大程度上的減少，雖然在實驗進行10h、20h的時候轉(zhuǎn)染前后差異較?。╬>0.05），但是30h以后，轉(zhuǎn)染前后期差異較大（p<0.05），具有統(tǒng)計學意義。還能夠看出，未轉(zhuǎn)染和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)的情況下，侵蝕細胞數(shù)沒有很大差異。具體見表1。

2.3 轉(zhuǎn)染前后MKN-28胃癌細胞明膠酶活性的情況

聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細胞的負染帶寬度比轉(zhuǎn)染前顯著變窄，并且亮度也隨之減弱，其轉(zhuǎn)染前的積分吸光度值為31.2±0.56，轉(zhuǎn)染后為27.8±0.51，兩者相比具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染p16基因的胃癌細胞其基質(zhì)膜降解和侵襲轉(zhuǎn)移能力都有所下降。

3討論

根據(jù)國內(nèi)外大量的研究資料顯示[3]，抗遺傳基因家族可以通過對腫瘤細胞間或者是腫瘤細胞外的細胞基質(zhì)的作用進而影響到腫瘤細胞的浸潤以及轉(zhuǎn)移的能力，所以這里基因在控制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的過程中顯示出非常重要的作用。目前臨床醫(yī)學中已經(jīng)證實，p16與胃癌細胞的轉(zhuǎn)移具有很大的關(guān)系[4]。

侵襲、轉(zhuǎn)移是胃癌等惡性腫瘤最為基本的性質(zhì)，防止其轉(zhuǎn)移和侵襲是降低死亡率的主要方法之一。而這些腫瘤細胞的運動能力是使其自身發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要作用。其主要的侵襲轉(zhuǎn)移過程是先通過膜表面受體與基底膜發(fā)生粘附，然后它會釋放出蛋白明膠酶并且將基底膜進行分解，之后才會運動穿過基底膜[4]。而p16基因可能會使其釋放的明膠酶活性降低甚至是失去活性進而不能夠使基底膜受到分解，所以會抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移與運動。

故本次研究采用p16基因作為胃癌細胞轉(zhuǎn)移抑制劑，旨在探討它對胃癌細胞的轉(zhuǎn)移的抑制作用。研究結(jié)果顯示，在胃癌細胞MKN-28進行轉(zhuǎn)染后，在明確的蛋白位置出現(xiàn)p16的特異性目的蛋白質(zhì)條帶；轉(zhuǎn)染后胃癌細胞穿透基底膜的數(shù)量與為傳染相比有很大程度上的減少，雖然在實驗進行10h、20h的時候轉(zhuǎn)染前后差異較?。╬>0.05），無統(tǒng)計學意義，但是30h以后，轉(zhuǎn)染前后期差異較大（p<0.05），具有統(tǒng)計學意義。并且進過聚丙烯酰胺凝膠電泳測試后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細胞的負染帶寬度比轉(zhuǎn)染前顯著變窄，其并且轉(zhuǎn)染前的積分吸光度值為31.2±0.56，轉(zhuǎn)染后為27.8±0.51，兩者相比具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

故p16基因?qū)τ谝种莆赴┘毎霓D(zhuǎn)移可能是通過對癌細胞的侵襲和運動能力的控制得以實現(xiàn)的，p16可以有效地對胃癌細胞的轉(zhuǎn)移進行控制，為以后治療研究胃癌的轉(zhuǎn)移機制提供了依據(jù)。

參考文獻：

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[2]王犇，呂志發(fā)，謝勇.幽門螺桿菌感染、P16基因甲基化與胃癌[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2014，34（9）：1301-1304.

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