方勇 肖娟 劉重元 張志偉

摘要 ：目的：觀察LMP1羧基末端活性區(qū)3（CTAR3）在鼻咽癌干細(xì)胞遷移與侵襲中的作用。方法：首先建立LMP1和CTAR3缺失突變型LMP1（LMP1△252-351）的鼻咽癌干細(xì)胞SP18細(xì)胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351）；然后觀察LMP1和LMP1△252-351對(duì)SP18細(xì)胞遷移與侵襲的影響。結(jié)果：SP-LMP1△252-351細(xì)胞的遷移與侵襲能力較SP-LMP1細(xì)胞顯著降低（n=3，P<0.05）。結(jié)論：LMP1羧基末端CTAR3是其促鼻咽癌干細(xì)胞遷移與侵襲的重要功能活性區(qū)域。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌干細(xì)胞；LMP1；遷移與侵襲

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)衡陽聯(lián)合基金（No.12JJ9033）；湖南省科技廳項(xiàng)目（No.2013SK3118、2014SK3081）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)基金（No.10K052、12K094、13K083）；衡陽市科技局項(xiàng)目（No.2013KJ12、2013KJ28）

Abstract： Objective Observed the role of carboxy terminal activating region 3（CTAR3） of latent membrane protein 1（LMP1） in process of migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell. Methods The SP18 cell of stable expressed LMP1 and deletion mutant type LMP1 （LMP1△232-351） were established （SP18-LMP1and SP18-LMP1△252-351）. The effect of LMP1 and LMP1△232-351 for cellular migration and invasion were observed in SP18 cells. Results The migration and invasion of SP-LMP1△252-351 cells was obviously decreased to compare with SP-LMP1 cells （n=3， P<0.05）. Conclusion The LMP1-CTAR3 is important carboxy terminal activating region to promote migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell SP18 cell.

Keywords： nasopharyngeal carcinoma stem cell， LMP1， migration and invasion

潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein，LMP1）是EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）編碼的具有促細(xì)胞癌變和轉(zhuǎn)移作用的瘤蛋白[1]，該蛋白的羧基末端有三個(gè)功能活性區(qū)域（carboxyl terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3，它們是誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的重要功能活性位點(diǎn)[2]。腫瘤干細(xì)胞決定腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源[3，4]。至今，LMP1 在鼻咽癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用仍不十分清楚。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 質(zhì)粒 逆病毒質(zhì)粒pLNSX-LMP1（含全長1.95kb野生型LMP1）和pLNSX-LMP1△232-351 （CTAR3缺失，含1.59kb的LMP1）由中南大學(xué)腫瘤研究所賀智敏教授惠贈(zèng)[5，6]。

1.1.2 細(xì)胞 鼻咽癌干細(xì)胞SP18細(xì)胞株[7]由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng)，該細(xì)胞用含5%小牛血清（購自杭州四季青公司）的DMEM（Gibco BRL公司）培養(yǎng)。

1.1.3 試劑 Matrigel基質(zhì)膠（5mg/ml）為BD公司產(chǎn)品，Transwell小室（3428型）為Corning公司產(chǎn)品。單克隆抗體（一抗和二抗）購自Zymed Ltd，AMV Reverse Transcription 試劑盒購自Promega公司，G418和Liperfect2000脂質(zhì)體購自invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 建立穩(wěn)定表達(dá)LMP1和LMP1△232-351的SP18細(xì)胞 將SP18細(xì)胞種于6孔板中，分別用RV-LMP1和RV-LMP1△232-351逆病毒（加入8mg/L聚凝胺）37℃孵育SP18細(xì)胞2次（3～4 h/次，間隔8～12 h/次），然后400μg/ml G418篩選2周，匯合克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，建成穩(wěn)定表達(dá)LMP1和LMP1△232-351的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351），用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)LMP1的表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞爬片，用甲醇與丙酮（1：1）固定、洗片、干燥后，用抗LMP1一抗（1：500）標(biāo)記1 h（37℃），PBS洗片，用FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗標(biāo)計(jì)1 h（37℃），PBS洗滌，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn) 取數(shù)生長期細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至80%-90%融合度，用PBS洗洗細(xì)胞3次，加入新鮮無血清DMEM，用10μl TP頭比著直尺在6孔板中劃痕，用PBS洗細(xì)胞3次，加入無血清DMEM，37℃、5% CO2的培養(yǎng)。按0與24h測(cè)量與拍照，計(jì)算平均值并進(jìn)行分析。

1.2.4 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 采用濾膜直徑6.5mm，濾膜孔徑8.0μm 的Transwell培養(yǎng)板。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)過程，用無血清DMEM以1：5稀釋基質(zhì)膠，加入Transwell上室，37℃、5% CO2培養(yǎng)2 h。用無血清DMEM制備1×105個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，加入200 μl于Transwell上室，下室加入500 μl 5%小牛血清DMEM，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦凈上室面基質(zhì)膠，下室用4%多聚甲醛固定15min，將小室倒置風(fēng)干，結(jié)晶紫染色后，觀察和拍照，選取上、下、左、右和中5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后計(jì)算平均數(shù)并進(jìn)行分析。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)步驟一致，實(shí)驗(yàn)時(shí)不加入基質(zhì)膠即可。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以Mean+SD表示，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LMP1和LMP1△252-351蛋白的表達(dá)檢測(cè)

細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，LMP1和LMP1△252-351蛋白表達(dá)于SP18細(xì)胞漿和膜，建立了穩(wěn)定表達(dá)LMP1和LMP1△252-351的SP18細(xì)胞系，即SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351細(xì)胞（見圖1）。

SP18-LMP1 SP18-LMP1△232-351

圖1 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)LMP1和LMP1△252-351蛋白的表達(dá)

2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察LMP1和LMP1△232-351對(duì)SP18細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕（圖2和表1）結(jié)果顯示，SP18-LMP1△232-351細(xì)胞的遷移率較SP18-LMP1細(xì)胞低（n=3，P<0.05），說明SP18-LMP1△232-351細(xì)胞的遷移能力較SP18-LMP1細(xì)胞低，提示LMP1可促進(jìn)SP細(xì)胞的遷移，CTAR3是LMP1促進(jìn)細(xì)胞遷移的重要活動(dòng)區(qū)域。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LMP1△232-351對(duì)SP18細(xì)胞遷移

A1： SP18-LMP1細(xì)胞在0h情況； A2： SP18-LMP1細(xì)胞在24h情況；

B1： SP18-LMP1△232-351細(xì)胞在0h情況； B2： SP18-LMP1△232-351細(xì)胞在24h情況。

表1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP18-LMP1和 SP18-LMP1△232-351細(xì)胞遷移情況

2.3 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LMP1和LMP1△232-351對(duì)SP18細(xì)胞的影響

Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3和表2）顯示，SP18-LMP1△232-351細(xì)胞的遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)較SP18-LMP1細(xì)胞少（n=3，P<0.05），說明SP18-LMP1△232-351細(xì)胞的遷移與侵襲能力較SP18-LMP1細(xì)胞低，同樣提示LMP1可促進(jìn)SP細(xì)胞的遷移與侵襲， CTAR3是LMP1促進(jìn)細(xì)胞遷移與侵襲的重要活動(dòng)區(qū)域。

圖3 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LMP1△232-351對(duì)SP18細(xì)胞遷移與侵襲的影響

A： SP18-LMP1細(xì)胞遷移情況； B： SP18-LMP1△232-351細(xì)胞的遷移情況；

C： SP18-LMP1細(xì)胞的侵襲情況； D： SP18-LMP1△232-351細(xì)胞的侵襲情況。

表2 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351細(xì)胞遷移與侵襲情況

3 討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一，LMP1是目前EB病毒編碼少數(shù)幾個(gè)被確認(rèn)與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的致瘤蛋白。LMP1羧基末端第三個(gè)活性區(qū)域由Gires等[7]1999年首次提出，其在淋巴細(xì)胞中與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。LMP1-CTAR3可以激活JAK3/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)鼻咽上皮細(xì)胞的增殖[8]。Bentz GL等最新研究表明[9]，羧基末端活化區(qū)域3通過與UBC9之間相互作用可促進(jìn)LMP1介導(dǎo)的細(xì)胞遷移，提示CTAR3在LMP1對(duì)腫瘤遷移侵襲的影響及其機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。

腫瘤干細(xì)胞假說是近年來提出的關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移新理論，是指腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤轉(zhuǎn)移的原因。鼻咽癌干細(xì)胞SP18細(xì)胞系是2007年中山大學(xué)腫瘤防治中心曾益新等建立的一類具有干細(xì)胞特性的鼻咽癌干細(xì)胞[10]，鼻咽癌干細(xì)胞在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。

我們以往的研究證實(shí)，CTAR3是LMP1發(fā)揮生物學(xué)作用的主要區(qū)域，其可以激活JAK3/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)鼻咽上皮細(xì)胞的增殖[11]。本研究結(jié)果顯示，LMP1能促進(jìn)鼻咽癌干細(xì)胞SP18的遷移及侵襲，CTAR3缺失后LMP1促進(jìn)遷移及侵襲能力明顯降低，提示CTAR3是LMP1促進(jìn)鼻咽癌干細(xì)胞SP18遷移及侵襲的重要活性區(qū)域，至于CTAR3通過何種信號(hào)途徑發(fā)揮其促進(jìn)鼻咽癌干細(xì)胞SP18遷移及侵襲，仍有待深入研究。

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