白春霞等

摘要：目的 優(yōu)選復方金鈴四逆四物失笑散顆粒中揮發(fā)油提取工藝及羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）包合工藝。方法 采用L9（34）正交試驗，以揮發(fā)油提取量為評價指標，確定最佳提取工藝。以揮發(fā)油包合率和包合物收得率綜合評分為評價指標，優(yōu)選最佳包合工藝。采用薄層層析法（TLC）對包合物進行表征分析。結果 最佳提取工藝：藥材粉碎度為20目，加8倍量水，蒸餾提取8 h。最優(yōu)包合工藝：揮發(fā)油與HP-β-CD投料配比為1∶6，包合溫度30 ℃，研磨2 h。TLC圖譜顯示揮發(fā)油已被包合并形成穩(wěn)定包合物。結論 優(yōu)選的提取和包合工藝質量穩(wěn)定、可行性強。

關鍵詞：復方金鈴四逆四物失笑散顆粒；揮發(fā)油；羥丙基-β-環(huán)糊精；提取工藝；包合工藝；正交設計

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.026

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0095-04

Study on Extraction Process of Volatile Oil and Inclusion Preparation of Hydroxypropyl- β- cyclodextrin from Compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules BAI Chun-xia1， XIE Ping2， FENG Jian2， JIANG Chuan1， NING Hai-yan1 （1.Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China；2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China）

Abstract：Objective To optimize the extraction process of volatile oil and inclusion preparation of hydroxypropyl-β-cyclodextrin from compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules. Methods The orthogonal approach of L9 （34） was applied to investigate the volume of volatile oil extraction by 3 factors to obtain the optimum extraction conditions. With inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion compound as comprehensive evaluation indexes， the optimum preparation conditions were discussed. The characterization of this prepared inclusion was analyzed by TLC. Results The optimum extraction conditions were as follows：the crude medicine with medicinal powder was shattered into 20 meshes；8 times the amount of water was added and was extracted for 8 h. The best inclusion conditions were as follows：the proportion of volatile oil to HP-β-CD was 1∶6， with inclusion temperature of 30 ℃， grinding time of 2 h. Analysis results of TLC showed that stable inclusion compound was formed from volatile oil and HP-β-CD. Conclusion The optimized extraction process and inclusion preparation are with stable quality and high feasibility.

Key words：compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules；volatile oil；HP-β-CD；extraction process；inclusion preparation；orthogonal approach

復方金鈴四逆四物失笑散顆粒（以下簡稱“復方失笑散顆?！保槌啥贾嗅t(yī)藥大學附屬醫(yī)院名老中醫(yī)針對原發(fā)性痛經實證病機“不通則痛”，在古方基礎上加減而得，處方主要由延胡索、柴胡、枳殼、當歸、川芎、五靈脂等中藥組成，具有理氣活血、化瘀止痛之效。揮發(fā)油是方中當歸、枳殼、柴胡及川芎主要活

通訊作者：馮儉，E-mail：fengjan222@tom.com

性成分，具有易揮發(fā)、氧化變質及對光、熱穩(wěn)定性差等特性，在制劑過程中要避免揮發(fā)損失而保證藥效。

羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β- cyclodextrin，HP-β-CD）為揮發(fā)油包合輔料，其外部親水性結構及內部親脂性內腔能與脂溶性藥物形成水溶性包合物[1]，不僅溶解性高、對熱穩(wěn)定，且對腎、肌肉和黏膜幾乎無刺激，是一種低毒、安全、有效的水溶性包合輔料[2]。本試驗結合HP-β-CD包合材料，采用L9（34）正交設計和多指標綜合評分法對藥材進行提取工藝和包合工藝研究，從而控制制劑質量。

1 儀器與試藥

AS10300A型超聲清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器），FW135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司），101A-I真空干燥箱（上海亞明熱處理設備有限公司），揮發(fā)油測定器（上海玻璃儀器廠），ZF-90多功能暗箱式紫外儀（上海寶山顧村電光儀器廠）。

川芎、當歸、柴胡、枳殼均購自成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，經成都中醫(yī)藥大學藥學院嚴鑄云教授鑒定，均符合2010年版《中華人民共和國藥典》相關項下規(guī)定。HP-β-CD（天津市博迪化工有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 正交試驗 根據預試驗結果，按復方質量配比（1∶1∶1∶1）稱取藥材共120 g，采用L9（34）法，以藥材粉碎度（A）、加水倍量（B）、蒸餾時間（C）為考察因素（見表1），以揮發(fā)油得量為評價指標，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄揮發(fā)油測定甲法[3]提取揮發(fā)油，優(yōu)選提取工藝，結果見表2、表3。

直觀分析可見，各因素對揮發(fā)油得率的影響次序為A>C>B>D；方差分析顯示，因素A和C對揮發(fā)油得量有顯著影響（P<0.05），因素B對揮發(fā)油得量影響不大（P>0.05），為節(jié)約原料、降低成本，故選擇加水量為8倍量。結合生產實際確定揮發(fā)油提取工藝為A2B1C3，即藥材粉碎度20目、加8倍量水、提取8 h。

2.1.2 驗證試驗 精密稱取復方比例混合藥材3份，按上述工藝參數進行驗證試驗，平均揮發(fā)油得量為1.46 mL，RSD=0.79%，表明此工藝條件重復性好。

2.2 揮發(fā)油提取

分別稱取4味藥材各600 g，按上述工藝參數提取揮發(fā)油，冷卻，用乙醚萃取3次，合并乙醚液，35 ℃下回收乙醚至小體積，加無水硫酸鈉脫水，過濾，揮干乙醚，密閉保存。

2.3 包合工藝優(yōu)化

2.3.1 制備方法考察 根據文獻[4-5]，分別采用研磨法、水溶液攪拌法、超聲波法對揮發(fā)油進行包合，以揮發(fā)油包合率為評價指標，選擇最優(yōu)包合方法。

2.3.1.1 研磨法 稱取HP-β-CD 6 g，加蒸餾水30 mL，研磨成糊狀，緩慢滴加1 mL揮發(fā)油，溫水浴中研磨3 h，取出冷卻，冷藏24 h，抽濾，沉淀用石油醚洗滌，50 ℃真空干燥4 h，得粉狀包合物。

2.3.1.2 水溶液攪拌法 稱取HP-β-CD 6 g，加蒸餾水30 mL，置恒溫磁力攪拌器上，攪拌（200 r/min）成飽和水溶液，緩慢滴加1 mL揮發(fā)油，恒溫40 ℃攪拌3 h，取出冷卻，冷藏24 h，抽濾，沉淀用石油醚洗滌，50 ℃真空干燥4 h，得粉狀包合物。

2.3.1.3 超聲波法 稱取HP-β-CD 6 g，加蒸餾水30 mL，超聲混勻，緩慢滴加1 mL揮發(fā)油，恒溫40 ℃超聲處理3 h，取出冷卻，冷藏24 h，抽濾，沉淀用石油醚洗滌，50 ℃真空干燥4 h，得粉狀包合物。

2.3.2 包合物質量評價 取等量上述3種包合物，分別置圓底燒瓶中，加100 mL蒸餾水，提取4 h以上，至油量不再增加時停止加熱，測定包合物中揮發(fā)油回收量。同時，精密移取1 mL揮發(fā)油，置圓底燒瓶中，同法操作，測得平均空白回收率（揮發(fā)油測得量÷揮發(fā)油加入量×100%）為89%。計算揮發(fā)油包合率[包合物中實際揮發(fā)油量÷（揮發(fā)油加入量×空白回收率）×100%]，結果研磨法>水溶液攪拌法>超聲波法，見表4。采用最小顯著性差異法對3組數據進行統計分析，結果見表5。方差分析結果顯示，3組樣本均數兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。綜合分析，選擇研磨法為揮發(fā)油最佳包合方法。

2.3.3 正交試驗 采用研磨法，選擇對試驗結果影響較大的揮發(fā)油與HP-β-CD投料比（A）、包合溫度（B）及研磨時間（C）為考察因素（見表6）。以揮發(fā)油包合率和收得率[包合物質量÷（HP-β-CD量+揮發(fā)油加入量）×100%]的綜合評分為評價指標，二者權重系數分別為70和30，優(yōu)選最佳包合工藝，結果見表7、表8。

直觀分析顯示，各因素水平作用主次順序為A>B>C，A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C1>C2。方差分析結果表明，因素A對揮發(fā)油包合存在顯著影響（P<0.05），而因素B和C對包合結果影響不大（P>0.05）?？紤]省時節(jié)能問題，包合溫度選擇30 ℃，研磨時間選取2 h。故各因素水平優(yōu)化組合為A2B1C1，即揮發(fā)油與HP-β-CD投料比為1∶6、包合溫度為30 ℃、研磨2 h。

2.3.4 驗證試驗 精密稱取適量揮發(fā)油和HP-β-CD各3份，按上述工藝進行驗證試驗，包合物收得率、揮發(fā)油包合率平均值分別為86.26%、88.35%，RSD分別為1.28%、1.10%，表明此包合工藝穩(wěn)定、可行。

2.3.5 包合物穩(wěn)定性試驗 取按上述最佳工藝制備的包合物7份置于燒杯中，另取揮發(fā)油1 mL置于有等體積水量的燒杯中，于50 ℃通風恒溫箱放置7 d，并分別于1、2、3、4、5、6、7 d取樣，測定樣品溶液中揮發(fā)油得量，結果見圖1。可見，包合物中油釋放率明顯低于油水混合物中的釋放率，7 d后包合物含油量明顯高于油水混合物含油量，表明揮發(fā)油已被包合并形成穩(wěn)定包合物。

圖1 揮發(fā)油HP-β-CD包合物穩(wěn)定性分析

2.3.6 包合物薄層層析分析 取包合物3 g，加95%乙醇30 mL溶解，振搖后靜置1 h，過濾，取濾液，作為供試品溶液a；精密移取揮發(fā)油0.5 mL，加95%乙醇30 mL溶解，作為供試品溶液b；取包合物3 g，置100 mL圓底燒瓶中，加95%乙醇30 mL回流1 h，冷卻，過濾，取濾液，作為供試品溶液c；取空白HP-β-CD 3 g，同法制得供試品溶液d。吸取上述4種樣品，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶1）為展開劑，展開，取出，揮干，噴以5%香草醛酸溶液顯色，置紫外光 燈（365 nm）下檢視。結果顯示：b和c出現相同顏色熒光斑點，說明揮發(fā)油在包合前后成分未發(fā)生變化；a和d無相應斑點出現，表明揮發(fā)油已被HP-β-CD包合并形成包合物。

3 討論

環(huán)糊精在藥物制劑方面應用越來越廣泛，β-環(huán)糊精（β-CD）應用最多，但因其本身水溶解度較低而限制了其在藥學鄰域中進一步開發(fā)利用[6]。HP-β-CD較β-CD具有更好的水溶性和穩(wěn)定性，可提高油利用率和包合物得率，降低生產成本。同時，HP-β-CD克服了β-CD非胃腸道給藥的腎毒性缺點，為中藥新劑型開發(fā)提供了輔料基礎。

在提取工藝研究中，發(fā)現藥材粉碎度增大，顆粒間吸附力增大，提取率降低，且易發(fā)生糊化。藥材粉碎后宜立即提取，避免揮發(fā)油損失。本試驗對包合物3種制備方法進行考察，發(fā)現研磨法所得包合物粉末性狀細膩、均勻，便于制劑混合均勻。穩(wěn)定性試驗表明，包合能提高揮發(fā)油穩(wěn)定性并降低其釋放率，更有利于制劑。通過TLC對包合物進行分析，結果顯示，揮發(fā)油已被包合在HP-β-CD空腔結構內，并形成了穩(wěn)定分子包合物相。此外，包合完成后，宜低溫放置，以減少包合物反溶解，提高包合物收得率。

參考文獻：

[1] 丁平田，吳雪梅.藥物制劑的新型輔料2-羥丙基-β-環(huán)糊精[J].國外醫(yī)藥：合成藥、生化藥、制劑分冊，1996，17（2）：107-111.

[2] Tao T. Characteristics and pharmaceutical applications of hydroxypropyl-betacyclo-dextrin[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33（6）：304-309.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄63.

[4] 桂卉，劉東文，鄒龍，等.白術、木香混合揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物制備工藝的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（7）：1682-1684.

[5] 師白梅，嚴建業(yè)，王元清，等.當歸、枳殼揮發(fā)油的提取與包合工藝研究[J].中南藥學，2012，10（6）：401-405.

[6] 楊彩琴，王靜，紀桂霞.羥丙基β-環(huán)糊精對雙苯氟嗪包合作用的熱力學研究[J].化學研究與應用，2010，22（4）：23-27.

（收稿日期：2015-01-24）

（修回日期：2015-03-27；編輯：陳靜）