鄧思珊等

摘要：目的 研究福建草珊瑚基地不同地理種源的草珊瑚遺傳多樣性，構(gòu)建親緣關(guān)系圖。方法 采用CTAB法提取葉子中DNA，ISSR法對(duì)45個(gè)種源的草珊瑚樣品進(jìn)行DNA分子水平的分析評(píng)價(jià)，POPgen32軟件計(jì)算遺傳多樣性，建立基因樹譜，采用NTSYS軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果 6條ISSR引物共擴(kuò)增出630條條帶，遺傳多樣性分析表明45個(gè)品種平均有效等位基因數(shù)為1.620 2，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.364 5，平均Shannon信息指數(shù)為0.543 2。各位點(diǎn)遺傳多樣性程度也存在較大差別，Nei's基因多樣性指數(shù)最大值為0.497 2，最小值為0.1078；Shannon信息指數(shù)最大值為0.690 3，最小值為0.219 2。聚類分析結(jié)果顯示，以45個(gè)品種和14個(gè)位點(diǎn)的譜帶數(shù)據(jù)為原始矩陣，共獲得630個(gè)兩兩不同品種間的遺傳相似系數(shù)，不同組之間相似系數(shù)最大者為1.0，最小者為0.516。結(jié)論 福建三明種植的草珊瑚品種間存在豐富的遺傳變異，具有豐富品種的分子基礎(chǔ)。以0.610為閾值可以把45個(gè)不同地理種源的草珊瑚分為6個(gè)組。遺傳距離與種源地理遠(yuǎn)近無明顯相關(guān)。

關(guān)鍵詞：草珊瑚；ISSR法；遺傳多樣性；聚類分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.023

中圖分類號(hào)：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）09-0083-04

ISSR Analysis on Genetic Relationship of Fujian Sanming Sarcandra Glabra of Different Geographical Provenances DENG Si-shan1， LIU Hong-xu1， MENG Chun2， LIANG Yi-chi3， XU Rong-qing1， LIN Wen-jin1， ZHANG Ya-min1 （1.Fujian Academy of Medical Sciences， Fujian Provincial Key Laboratory of Medical Test， Fuzhou 350001， China；2.Fuzhou University， Fuzhou 350108， China；3.Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350108， China）

Abstract：Objective To study the genetic diversity in Fujian Sanming Sarcandra Glabra from different geographical provenances；To construct genetic relationship diagram. Methods DNA in leaves was extracted by CTAB. Analysis and evaluation of DNA molecular level of 45 samples of different geographical provenances were conducted by ISSR method. POPgen32 software was used to calculate the genetic diversity and establish gene trees. NTSYS software was used to carry out cluster analysis. Results Six ISSR primers amplified 630 bands. Genetic diversity analysis showed that the average effective number of alleles of 45 varieties was 1.620 2；the average Nei's genetic diversity index was 0.364 5；the average Shannon information index was 0.543 2. Each point had different levels of genetic diversity. Nei's genetic diversity index of the maximum value was 0.497 2， and the minimum value was 0.107 8；Maximum Shannon information index was 0.690 3， and the minimum value was 0.219 2. Cluster analysis results showed that 45 varieties and 14 loci band data were the primitive matrix. 630 genetic similarity coefficients between two different species were obtained. The maximum similarity coefficient among different groups was 1.0， and the minimum was 0.516. Conclusion Different varieties of Fujian Sanming Sarcandra Glabra exist abundant genetic variation and has the molecular basis of abundant species. Using 0.610 as the threshold value can divide Sarcandra Glabra from 45 different geographical provenances into 6 groups. The genetic distance and geographical distance was not related.

Key words：Sarcandra Glabra；ISSR；genetic diversity；cluster analysis

草珊瑚為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai的全株，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抑制流感病毒、促進(jìn)骨折愈合及鎮(zhèn)痛等功效。在保健品、日用品等領(lǐng)域也廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求旺盛。草珊瑚分布在我國以福建、江西為代表的南方各省。福建三明位于武夷山脈與戴云山脈之間的匯水區(qū)，氣候溫和，雨量充沛，土層深厚，森林覆蓋率高，是草珊瑚生長的理想?yún)^(qū)域。近年來，福建三明草珊瑚已形成產(chǎn)業(yè)，成為全國最大的人工草珊瑚種植基地，優(yōu)質(zhì)種源四五十種，來自當(dāng)?shù)丶案＝ā⒔?、浙江、廣東、廣西。在通過有效成分、生物量考察分析，科學(xué)篩選高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)的草珊瑚的研究之后[1]，有必要對(duì)不同地理種源的草珊瑚進(jìn)行遺傳多樣性分析，從分子水平研究種質(zhì)間的遺傳距離，為保護(hù)基地種質(zhì)資源、評(píng)價(jià)植物道地性和藥材品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

ISSR（inter-simple sequence repeat）是Zietkiewicz等于1994年發(fā)展起來的一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記[2]。其基本原理是：用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的ISSR區(qū)域多個(gè)條帶通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得以分辨，擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)。ISSR集隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、SSR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、耗資少，遺傳多態(tài)性高，已廣泛應(yīng)用于作物遺傳多樣性、種群親緣關(guān)系分析等方面[3-5]。本研究應(yīng)用ISSR法對(duì)三明三元草珊瑚基地不同地理種源的45個(gè)草珊瑚樣品進(jìn)行DNA分析評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

UV-1800型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），ABI7300 PCR儀（美國ABI公司），DYCP-34A型電泳槽（北京市六一儀器廠），J-25型離心機(jī)（德國HERMAL公司），DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠），CTK-50凝膠成像儀（英國SYNGENE公司）。

引物、Mg2+、dNTPs、10×PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、λ-EcoT14I Digest DNA Marker，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；三氯甲烷、異丙醇、乙醇、三水合乙酸鈉，西隴化工股份有限公司。

草珊瑚樣品于2011年1月福建三明三元區(qū)吉口采育場(chǎng)草珊瑚標(biāo)準(zhǔn)示范基地采集，來源信息見表1。摘取幼嫩葉片，陰干后置-20 ℃冷凍保存。樣品經(jīng)福建省藥品檢驗(yàn)所吳春敏主任藥師鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai的全株。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

采用CTAB大量提取法。稱取0.2～0.4 g新鮮或-20 ℃冷凍植物材料；把植物葉子和研缽一起放入-80 ℃冰凍20～60 min，CTAB放入62 ℃預(yù)熱；快速研磨葉子直至成粉末狀，加入少許預(yù)熱的CTAB繼續(xù)研磨，移入預(yù)熱好CTAB的離心管，置于65 ℃水浴30～45 min，期間搖動(dòng)幾次；12 000×g離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入等體積氯仿混勻，靜置片刻，12 000×g離心10 min；將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用等體積氯仿再抽提1次；加入等體積異丙醇，混勻，-20 ℃放置10 min，12 000×g離心15 min；棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，略晾干即可得到DNA粗制品；加入TE緩沖液，放入-20 ℃冰箱保存。

2.2 ISSR-PCR引物設(shè)計(jì)篩選

根據(jù)加拿大British Columbia大學(xué)公布的ISSR引物序列進(jìn)行篩選，獲得引物序列，上海生工生物技術(shù)公司合成，從100條引物中篩選出6條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、穩(wěn)定性良好的引物用于45個(gè)樣品的擴(kuò)增，最終確定的引物為801（AT）8T、807（AG）8T、813（CT）8T、824（TC）8G、835（AG）8YC、840（GA）8YT。

2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增條件

對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的Taq酶用量、Mg2+濃度、模板DNA用量、磷酸堿基脫氧核苷酸/dNTPs濃度和引物濃度等進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)?？?cè)莘e25 μL，包括模板DNA 30 ng，Taq酶20 nkat，0.4 μmol/L引物，2 mmol/L Mg2+，0.250 mmol/L dNTPs，10×PCR buffer 2.5 μL。

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s， 37 ℃復(fù)性30 min，72 ℃延伸80 s，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物中加入5 μL loading buffer，用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴乙錠染色，凝膠成像儀拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，凝膠上相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，沒有DNA條帶記為0，得到二元資料，形成0、1矩陣。采用POPgen32分析Nei's基因多樣性指數(shù)（He）和Shannon信息指數(shù)（I）。NTSYS2.10e軟件分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)算Nei's遺傳距離，使用UPMGA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建進(jìn)化樹圖。

3 結(jié)果

3.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的ISSR多態(tài)性

用6條ISSR引物對(duì)45個(gè)不同地理種源的草珊瑚進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出630條清晰條帶。穩(wěn)定的條帶片段在250～2000 bp。圖1為引物UBC 840對(duì)45份草珊瑚ISSR擴(kuò)增結(jié)果。引物序列及多態(tài)性分析見表2。通過POPgen32軟件對(duì)個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）和及Shannon信息指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，45個(gè)產(chǎn)地平均有效等位基因數(shù)為1.620 2，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.364 5，平均Shannon信息指數(shù)為0.543 2。

3.2 草珊瑚種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

各位點(diǎn)遺傳多樣性程度存在較大差別，Nei's基因多樣性指數(shù)最大值為0.497 2，最小值為0.107 8；Shannon信息指數(shù)最大值為0.690 3，最小值為0.2192，說明所選的樣品間存在豐富的遺傳變異，不同產(chǎn)地的草珊瑚具有豐富品種的分子基礎(chǔ)。

3.3 聚類分析

用NTSYS軟件，以45個(gè)樣品和14個(gè)位點(diǎn)的譜帶數(shù)據(jù)為原始矩陣，共獲得630個(gè)兩兩不同種源間的遺傳相似系數(shù)，不同組之間相似系數(shù)最大者為1.0，最小者為0.516。親緣關(guān)系聚類樹狀圖見圖2，以0.610為閾值可以把45個(gè)不同種源樣品分為6個(gè)類群。第Ⅰ大類由19個(gè)種源組成，包括樣品24、10、14、19、12、11、31、25、33、8、26、3、45、37、21、42、22、34和2，第Ⅱ大類由14個(gè)種源組成，包括樣品29、9、35、44、28、43、13、32、16、38、4、39、6和20，第Ⅲ大類由2個(gè)種源組成，包括樣品41和27，第Ⅳ大類8個(gè)種源組成，包括樣品1、36、18、5、40、7、17和15，第Ⅴ大類為樣品23，第Ⅵ大類為樣品30。其中24和10，12、11、31、25、33、8、26和3，38和4遺傳距離高度一致。

4 討論

草珊瑚是一種重要的藥用植物資源，由于市場(chǎng)需求量大，現(xiàn)已無野生資源，人工栽培方式的不同造成草珊瑚具有多樣性。筆者參考了多篇有關(guān)草珊瑚DNA的實(shí)驗(yàn)性文章[6-9]，大都僅停留在DNA提取和分子標(biāo)記方法研究上，尚未見同一生境不同種源草珊瑚遺傳多樣性研究報(bào)道。本研究樣品取自福建三明草珊瑚種植基地，種源來源多，研究其親緣關(guān)系對(duì)保護(hù)基地種質(zhì)資源、評(píng)價(jià)植物道地性具有重要意義。

研究結(jié)果表明，試驗(yàn)擴(kuò)增的ISSR片段多態(tài)性很高，不同種源間遺傳相似系數(shù)變幅較大。各位點(diǎn)遺傳多樣性程度存在較大差別，Nei's基因多樣性指數(shù)最大值為0.497 2、最小值為0.107 8，Shannon信息指數(shù)最大值為0.690 3，最小值為0.219 2，表明所選的不同地理草珊瑚種源間存在豐富的遺傳變異，具有豐富品種的分子基礎(chǔ)。同時(shí)表明，在長期的人工栽培和定向選擇培育過程中，不同地域和育種模式造成草珊瑚的種質(zhì)變異和進(jìn)化速率大大高于自然群，造成了DNA分子水平上的多樣性，具備較高的遺傳變異。無性繁殖技術(shù)的推廣應(yīng)用，進(jìn)一步造成了不同地域性草珊瑚DNA分子多樣性的維持。

聚類分析進(jìn)一步表明，試驗(yàn)所采用的草珊瑚可能主要由2種不同種質(zhì)的品系發(fā)育而來。聚類樹狀圖表明，遺傳距離高度一致的樣品12（福建華安）、11（浙江金華）、31（福建明溪）、25（福建建陽）、33（福建明溪沙溪）、8（廣東梅州）、26（福建沙縣南霞）和3（浙江新余）來自不同省份的不同地區(qū)，以及24（福建邵武）和10（浙江衢州）、38（福建三明三元曹源）和4（江西贛州）來自不同省份，卻有較近的遺傳距離。結(jié)果表明，福建三明草珊瑚基地的不同地理種源的草珊瑚不能完全反映種源的地理分布特點(diǎn)，不存在種源區(qū)域性特點(diǎn)，親緣關(guān)系與產(chǎn)地來源的地理遠(yuǎn)近距離并無明顯關(guān)系。不同來源草珊瑚的多態(tài)性，為分析中國不同地區(qū)草珊瑚的種植歷史、種植水平以及建立標(biāo)準(zhǔn)化種質(zhì)資源圃提供重要參考。分子多態(tài)性是否與草珊瑚的有效成分存在關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2015-01-09）

（修回日期：2015-02-02；編輯：陳靜）