劉濤 周正劍 王萍 成雄鷹
摘要 自從1992年第一株轉基因小麥誕生以來,小麥的轉基因技術經有了很大的發(fā)展。該研究分析了Web of knowledge數(shù)據庫和CNKI數(shù)據庫收錄的2010~2014年發(fā)表的關于普通小麥轉基因的文獻。篩選得到102篇英文文獻和103篇中文文獻,涉及296個試驗,共對152個普通小麥品種進行了遺傳轉化研究。目前小麥遺傳轉化主要采用基因槍和農桿菌介導法,分別占總試驗數(shù)的68.25%和30.4%;少數(shù)試驗使用花粉管通道和電轉化進行轉基因。轉化靶標組織主要是幼胚及其愈傷組織,占試驗總數(shù)的80.35%;其次為成熟胚來源的愈傷組織,占8.62%。Bar、HPT、NPTII、PMI和AtMYB12分別在不同的試驗中被使用,但Bar是最常用的篩選標記,占試驗總數(shù)的61.22%。不同試驗的轉化率相差較大,從0.1%到45%不等。
關鍵詞 小麥;轉化體系;文獻分析
中圖分類號 S126 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611(2015)34-345-05
小麥是世界上主要的糧食作物之一,2013年全球小麥產量7.15億t,僅次于玉米(10.18億t)和水稻(7.4億t)。然而小麥的生產受到多方面的威脅,分析2004~2013的全球小麥單產,發(fā)現(xiàn)小麥單產不穩(wěn)定,且增幅較小。最低單產是2007年的2 828.08 kg/hm2,最高的是2013年的3 268.30 kg/hm2。我國已成為世界上最大的小麥生產國,2013年我國小麥產量占世界產量的17.03%。2010~2014年,我國小麥產量增速減緩,平均年增長率僅為1.5%[1]。鑒于目前人口的持續(xù)增長和耕地的不斷減少。有必要采用多種措施穩(wěn)定或增加產量。
植物轉基因技術是利用現(xiàn)代生物技術的方法,將有利基因導入受體植物的基因組中,產生有附加值的性狀。近年來,轉基因產品在大豆、玉米和棉花上取得巨大的成功,創(chuàng)造了良好的經濟和社會效益。作為世界3大糧食作物之一,小麥的轉基因研究滯后于水稻和玉米,直到1992年才有Vasil利用基因槍法獲得世界上第一株轉基因小麥[2]。但至今小麥的遺傳轉化率仍較低,容易導致插入沉默,且表現(xiàn)出很強的品種依賴性[3]。但隨著技術的發(fā)展,新的遺傳改良工具CRISPRCas[4]和TALEN[5]等技術的發(fā)展,為高效的植物改良提供了新的途徑。而且這些技術的應用都需要通過遺傳轉化技術來實現(xiàn)。
在Web of knowledge數(shù)據庫是由湯森路透(Thomson Reuters)開發(fā)維護的全球最大的生命科學數(shù)據庫,包括2 000多種來自世界各地的期刊[6]。CNKI是我國最大的文獻數(shù)據庫,覆蓋96%的中文期刊[7]。筆者搜集整理了2010~2014年Web of knowledge數(shù)據庫和CNKI的文獻數(shù)據庫收錄的關于普通小麥轉基因的文獻,系統(tǒng)地分析以往的小麥遺傳轉化研究,旨在更全面地了解小麥遺傳轉化的過程和現(xiàn)狀,比較不同實驗技術的優(yōu)缺點,為進一步提高小麥遺傳轉化效率提供新的思路。
1 研究方法與數(shù)據來源
1.1 文獻收集方法
在Web of knowledge數(shù)據庫中,首先使用“Year Published=(2010-2014)Timespan=All years Search language=English”搜索組合搜索統(tǒng)計文獻數(shù)目;再使用“Topic=(transgenic)AND Year Published=(2010-2014)Timespan=All years.Search language=English”搜索組合搜索統(tǒng)計文獻數(shù)目;然后使用“Topic=(wheat)AND Topic=(transgenic)AND Year Published=(2010-2014)Refined by:Databases=(BCI OR WOS OR MEDLINE)Timespan=All years.Search language=English”搜索組合進行搜索,統(tǒng)計文獻數(shù)目;在CNKI的文獻數(shù)據庫(http://epub.cnki.net/)首先使用發(fā)表時間20100101~20150101,進行搜索,統(tǒng)計文獻數(shù)目。再使用關鍵詞“轉基因”,范圍選擇為主題+發(fā)表時間為20100101~20150101,進行搜索,統(tǒng)計文獻數(shù)目。使用關鍵詞“轉基因”和“小麥”,范圍選擇為“主題”+發(fā)表時間為20100101~20150101進行搜索,統(tǒng)計文獻數(shù)目。使用同樣的方法對玉米和水稻的文獻狀況進行搜索,只統(tǒng)計文獻數(shù)目,不進行人工判讀。同時使用CNKI的成果數(shù)據庫(http://epub.cnki.net/kns/brief/result.aspx?dbPrefix=SNAD)、CIMMYT的wheat atlas數(shù)據庫(http://wheatatlas.cimmyt.org/)和USDA的GRIN數(shù)據庫(http://www.arsgrin.gov/)獲得文獻中使用小麥品種的詳細信息。
1.2 文獻的篩選和信息收集
對搜索出的文獻進行人工判讀,排除摘要、重復文章、會議文章、綜述文章和以非普通小麥為受體的文章。收集篩選出的文獻的下列試驗信息:受體品種、外植體、轉基因方法、篩選基因和轉基因效率。其中外植體主要分為幼胚和成熟胚2類:轉化受體為幼胚和幼胚誘導的愈傷都被歸為幼胚類;受體為成熟胚和成熟胚誘導的愈傷歸為成熟胚類。轉基因效率=陽性植株/侵染受體數(shù)目。
2 結果與分析
2.1 小麥轉基因研究的活躍度
對上述搜索條件下獲取的文獻數(shù)目進行分析,用相關作物文獻所占的比例來表示該作物轉基因研究的活躍度,結果見表1。由表1可知,在Web of knowledge數(shù)據庫中,水稻轉基因的文獻數(shù)目是小麥轉基因文獻數(shù)目的5.86倍。玉米轉基因文獻數(shù)目是小麥轉基因文獻數(shù)目的1.88倍。在CNKI數(shù)據庫中同樣發(fā)現(xiàn),水稻轉基因的文獻數(shù)目是小麥轉基因文獻數(shù)目的2.98倍,玉米轉基因文獻數(shù)目是小麥轉基因文獻數(shù)目的2.18倍。說明在這3種作物中,水稻轉基因研究最活躍,玉米轉基因研究次之,小麥轉基因研究最少。
2.2 受體品種
小麥按低溫春化時間長短,可分為春性小麥和冬性小麥。按播種時間可分為春小麥和冬小麥。春小麥一般是春性小麥,而冬小麥可能是春性小麥或冬性小麥[8]。春性品種小麥被選為受體材料的比例遠大于(3∶1)非春性品種。春性小麥不需要低溫春化即可抽穗結實,可以春播,生育期短。而冬性品種因需要低溫春化才可抽穗結實,必須秋播或人工春化,生育期較長。例如春性品種“隴春23”在甘肅省春播,生育期只有100 d[9],而半冬性品種“周麥16”在河南省秋播,生育期為236 d[10]。因此春性小麥在幼胚供應、培養(yǎng)周期和轉基因苗結實率3個方面具有明顯的優(yōu)勢。
在Web of knowledge數(shù)據庫中檢索到921篇文獻,經篩選得到103篇英文文獻,信息收集結果如表2。103篇文獻涉及137個轉化試驗,共用了68個普通小麥品種。137個試驗中,41個試驗采用品種Bobwhite,占試驗總數(shù)29.93%。CNKI數(shù)據庫中檢索到834篇文獻中,經篩選103篇中文文獻符合要求。信息收集結果如表3。103篇文獻涉及157個轉化試驗,對84個普通小麥品種進行了轉化。157個試驗中,25個使用揚麥系列品種做為受體材料,占實驗總數(shù)15.92%。小麥品種按生態(tài)類型進行分類,Web of knowledge數(shù)據庫收集的139個試驗中有103個試驗的受體品種確定了生態(tài)類型,其中使用春性品種的有94個,占試驗總數(shù)的91.26%。CNKI數(shù)據庫收集的157個試驗中,130個試驗所采用的品種確定了生態(tài)類型。其中82個試驗使用了春性品種,占試驗總數(shù)的63.08% ??偣?33個轉基因試驗中有176個使用了春性品種,占試驗總數(shù)的75.54%。
英文文獻試驗中使用頻率最高的Bobwhite為墨西哥春性小麥品種。CIMMYT研究了129個Bobwhite姐妹系的轉化效率。其中Bobwhite SH9826獲得了73.81%的轉化效率,在所見文獻中最高[11]。但品種Bobwhite的農藝性狀較差,影響轉基因技術的直接應用[12]。中文文獻中使用最多的小麥品種為揚麥系列。張月婷等[13]使用品種“揚麥158”的幼胚為外植體,經過農桿菌介導、Bar基因篩選,獲得了2.33%的轉化效率。在總共178個試驗中有28.65%選擇了這2個系列的品種,可以推測它們在目前的轉化體系下的轉化效率是穩(wěn)定的。
Terese Richardson等[14]用同樣的轉化方法對10個小麥品種的進行轉化,比較轉化率發(fā)現(xiàn),差異巨大,最高的轉化率為45%,最低為0。Pellegrineschi等[11]研究了129個Bobwhite姐妹系的轉化效率,得到了類似的結論,轉化率的分布從0到73.81%。由此可以看出小麥轉化表現(xiàn)出很強的品種依賴性。表明轉化效率在一定程度上受品種的遺傳特性影響。
2.3 外植體
由圖1可知,Web of knowledge數(shù)據庫收集的137個試驗,使用了3種外植體,分別為幼胚、成熟胚、生長點。117個試驗采用幼胚為外植體,占試驗總數(shù)的85.40%。13個試驗選用成熟胚為外植體,占試驗總數(shù)的9.49%。CNKI數(shù)據庫收集的157個試驗,使用了4種外植體,分別為幼胚、幼穗、成熟胚和生長點。114個試驗以幼胚為外植體,占試驗總數(shù)的72.61%。12個試驗以成熟胚為外植體,占試驗總數(shù)的7.64%。25個試驗采用生長點為外植體,占試驗總數(shù)的15.92%。
高通量的轉化體系要求外植體具有穩(wěn)定高效的再生能力,一般不應低于80%,且以叢生芽再生植株形式為宜[15]。幼胚是目前使用頻率最高的外植體,且獲得的轉化率也最高。一般選取開花后12~14 d左右的幼胚,大小為0.5~1.5 mm[16-22]。但幼胚的供應受時間限制且幼胚的狀態(tài)也很難控制,造成以幼胚為外植體的轉化實驗的重復性差。成熟胚則沒有以上問題,種子可以方便的保存在實驗室內,隨時使用且質量均一,試驗重復性好[23-24]。但成熟胚的再生能力不如幼胚。近些年在有許多學者對成熟胚的再生能力進行研究。Moghaieb等[25]使用小麥品種“Gemmiza10”和“Gemmiza9”的成熟胚進行農桿菌轉化試驗,獲得了95%和87.5%的再生頻率,最終的轉化率為8.8%和6.9%[25]。Raja等[26]使用小麥品種“Tartara2002”的成熟胚進行農桿菌轉化試驗,獲得了40%的轉化效率。我國學者張東武等[27]使用品種“西農928”的成熟胚為外植體,通過基因槍介導轉化,以Bar基因為篩選標記,獲得了1.2%的轉化效率。Ding等[28]使用“鄂麥12”的成熟胚為外植體,用農桿菌介導轉化,以Bar基因為篩選標記,獲得了1.52%的轉化效率。生長點和幼穗是植物生長分化的活躍部位,利用農桿菌對這些部位進行活體侵染,在后代可得到陽性轉化苗[29-30]。生長點和幼穗為外植體進行轉化有明顯的優(yōu)勢,主要包括不依賴于組織培養(yǎng)、不受基因型限制、操作方便,不受設備限制;同時劣勢也十分明顯,轉化率低、容易產生嵌合體和轉化體系不成熟,限制了這些外植體的使用[31]。
2.4 轉化方法
由圖2可知,Web of knowledge數(shù)據庫收集的137個試驗,使用了3種方法介導小麥轉基因,分別為基因槍介導法、農桿菌介導法和花粉管通道法。91個試驗采用基因槍介導法進行轉基因,占試驗總數(shù)的66.42%。45個試驗使用農桿菌介導法完成基因導入,占總數(shù)的32.85%。CNKI數(shù)據庫收集的157個試驗使用了4種轉化方法(基因槍介導法、農桿菌介導法、花粉管通道法和電轉化法)。111個試驗應用基因槍介導法,占總試驗數(shù)的70.7%。43個試驗采用農桿菌介導法,占試驗總數(shù)的27.39%。
可以看出,目前小麥轉基因主要使用基因槍和農桿菌介導法。在總共294個試驗中,68.7%采用基因槍介導,31.29%使用農桿菌介導完成轉化。從轉化效率上看,基因槍法目前最高獲得73.81%的轉化率[11]。農桿菌法最高獲得41.00%的轉化率[14]。Hu等[18]比較了基因槍法和農桿菌法的轉化質量,發(fā)現(xiàn)農桿菌法得到的低拷貝的轉化事件優(yōu)于基因槍法。Sparks使用同一個轉化系統(tǒng),基因槍介導可以實現(xiàn)了35個小麥品種的轉化。而農桿菌介導只有少數(shù)幾個品種獲得了轉基因植株[32],推測原因是小麥品種對農桿菌不敏感。Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)與基因槍法比較,農桿菌介導的轉化事件能在后代中穩(wěn)定的遺傳表達,不會出現(xiàn)基因沉默的現(xiàn)象。
花粉管通道技術是利用作物授粉后所形成的天然花粉管通道(又稱花粉管引道組織)經珠心通道將 外源 DNA 攜帶入胚囊,轉化受精卵和其前后的生殖細胞(精子、 卵子),由于它們仍處于未形成細胞壁的類似 “原生質體” 狀態(tài),并且正在進行活躍的 DNA 復制、分離和重組,所以很容易將外源 DNA 的片段整合到受體基因組中,達到遺傳轉化的目的[34]。該法操作簡單,易于推廣,不受基因型限制,但轉化機理不清晰,受環(huán)境影響大,轉化效率低[35]。
2.5 篩選標記
由圖3可知,Web of knowledge數(shù)據庫收集的137個試驗,使用了5種篩選標記,分別為Bar、HPT、NPTII、PMI和AtMYB12。Bar基因使用最為普遍,占試驗總數(shù)的59.12%。HPT基因和NPTII基因次之,分別占試驗總數(shù)的10.22%和14.60%。AtMYB12是一種可視的報告基因,是黃酮醇生物合成專一性的激活因子。AtMYB12導入小麥中,提高小麥黃酮和花甘色素的含量?;ǜ噬氐拇罅勘磉_能夠使小麥表現(xiàn)出紅色或紫色[36]。CNKI數(shù)據庫收集的157個試驗也采用了上述5種篩選標記。Bar基因被97個試驗采用,占試驗總數(shù)的61.78%。NPTII基因在25個試驗中出現(xiàn),占試驗總數(shù)的15.92%。
圖3 CNKI和Web of science數(shù)據庫中使用各種篩選基因的頻數(shù)分布
Vasil等[2]獲得第一株轉基因小麥,使用的篩選標記是Bar基因。此后Bar基因在小麥轉化中被廣泛利用。在此次收集到的294個試驗中,180個試驗使用Bar基因為篩選標記,占試驗總數(shù)的61.22%。2002年Pellegrineschi等[11]使用Bobwhite的幼胚為外植體,用基因槍介導,以Bar基因為篩選標記,獲得了73.81%轉化效率,在所見文獻中最高。2003年Hu等[18]采用Bobwhite的幼胚為外植體,農桿菌介導,EPSPS基因為篩選標記,獲得了4.4%的轉化效率,說明EPSPS在小麥中也可應用[37]。
2012年Agnieszka Bińka等[38]在2個小麥品種“Kontesa”和“Torka”對比了Bar和NptII 2種篩選標記的效率,發(fā)現(xiàn)在這2個小麥品種中,以NptII為篩選標記的轉化體系的轉化率顯著大于以Bar為篩選標記的轉化體系的轉化率[38]。由此可以看出轉化率和篩選標記之間存在關系,選擇合適的篩選標記,可以提高轉化效率。
2.6 轉化效率
Web of knowledge數(shù)據庫收集的137個試驗中有50個提供了轉化效率,最小的轉化效率為0.28%,最大的為45%,中位數(shù)是2.1%。最大的轉化效率來源于Richardson等[14],試驗采用小麥品種Westonia的成熟胚為外植體,誘導愈傷組織。使用農桿菌(AGL1)介導進行遺傳轉化,bar為篩選基因。CNKI數(shù)據庫收集的157個試驗中有100個提供了轉化效率,其中最小的為0.1%,最大的為34.8%,中位數(shù)為0.66%。王維[30]采用農桿菌(EHA105)將水稻OsDREB2.1基因導入小麥品種周麥16和冀麥38的幼穗中,獲得了34.8%的轉化效率。蔡琳[39]使用基因槍介導法,以小麥品種隴春23的幼胚為外植體,Bar基因為篩選基因,獲得了15.88%的轉化效率。值得一提的是,在所有提供轉化效率的試驗中,75.33%轉化率低于3%。
3 結論
文獻分析結果表明,農桿菌和基因槍法能有效地轉化小麥,Bar基因是可靠的篩選標記,受體材料受基因型限制明顯。受體組織主要依賴于幼胚,但有些基因型的成熟胚轉化成功,說明在小麥遺傳轉化中成熟胚有進一步利用的潛力。
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