盧美娟 邵京 張紅星 許超 凌曉君

摘要 [目的] 為芡實的深度開發(fā)與利用提供基礎(chǔ)理論參考。[方法]通過單因素試驗和正交試驗對超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取芡實中多糖的工藝條件進行了優(yōu)化，確定其最佳工藝參數(shù)。[結(jié)果] 芡實多糖提取的最佳工藝參數(shù)為：纖維素酶1.5%，果膠酶1.0%，酶解溫度35 ℃，復(fù)合酶處理80 min；酶解后進行超聲處理，料液比1∶10，超聲溫度60 ℃，超聲時間1.5 h。在此條件下的多糖提取率為12.38%。[結(jié)論] 該提取工藝簡單可行，對工業(yè)化生產(chǎn)芡實多糖具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 芡實；多糖；超聲波；復(fù)合酶

中圖分類號 S567；K284.2 文獻標(biāo)識碼A 文章編號 0517-6611（2015）34-161-03

芡實（Semen eurylie）是睡蓮科水生草本植物芡（Euryale ferox Salisb.）的成熟種仁，具有益腎固精、補脾止瀉、祛濕止帶的功效，是傳統(tǒng)的中藥材和珍貴的天然補品[1-3]。芡實多糖是一種特有的天然活性多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血糖、抗氧化和清除自由基等藥理活性，具有相當(dāng)高的藥用價值[4-6]。芡實中的糖脂類化合物（Glycolipid components）可以明顯改善老鼠心肌局部性貧血受損的癥狀[7-8]。

芡實質(zhì)地較硬，壁厚，多糖難以擴散出來，傳統(tǒng)方法提取芡實多糖的提取率低[9-10]。趙建國[11]、謝燕娟[12]和宋晶[13]等采用超聲波輔助法提取芡實多糖，主要是利用其空化效應(yīng)破壞植物細胞壁，從而有利于有效成分的溶出。由于植物材料的細胞壁主要由纖維素、木質(zhì)素和果膠質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成，纖維素酶和果膠酶等能使細胞壁疏松、破裂，減小傳質(zhì)阻力，從而提高有效成分的提取效率。采用超聲波同步協(xié)同酶法提取芡實多糖的研究尚未見報道。筆者對超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取芡實中多糖的工藝條件進行了優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)，旨在為芡實的深度開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料。芡實，市售，于60 ℃下烘干至恒重，粉碎。

1.1.2 主要試劑。無水乙醇、蒽酮、濃硫酸、無水葡萄糖對照品，以上均為分析純；纖維素酶，購自寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司；果膠酶，購自寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司。

1.2 試驗儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號DGG-9140A，上海森信實驗儀器有限公司）；高速萬能粉碎機

（型號FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）；電子天平（型號JA5003N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（型號DK-S26，上海森信實驗儀器有限公司）；低溫恒溫槽（型號DJB-3010，金壇市晶玻實驗儀器廠）；超聲波細胞粉碎機（型號BILON92-IID，上海比朗儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；紫外可見分光光度計（型號UV-1750，日本島津）；高速離心機（型號TG20-WS，長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 芡實多糖的提取工藝。芡實晾曬后于60 ℃下恒溫烘干，用粉碎機粉碎后密封保存。芡實多糖的工藝流程為：芡實→干燥粉碎→加復(fù)合酶酶解→超聲波提取→離心→上清液→減壓濃縮→醇沉→離心→冷凍干燥→粗碎、成品。

1.3.2 芡實多糖含量的測定。采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量[14]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品26.10 mg，加入蒸餾水溶解并定容至100 ml，得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.261 mg/ml）。精確移取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 ml置于20 ml具塞試管中，加蒸餾水至2 ml，精密加入蒽酮試劑（精密稱取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸溶液100 ml使溶解，搖勻）6 ml，搖勻，置于沸水浴中煮沸15 min，取出，放入冰水浴中15 min，取出。以相應(yīng)試劑為空白，在最大吸收波長625 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 0.003 9x+0.012（R2=0.999 2）。

稱取適量芡實粉，以水為溶劑，酶解超聲提取后，于6 000 r/min離心5 min，留上清液作為供試品溶液。取供試品溶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，搖勻，精確吸取2 ml置于20 ml干燥的具塞試管中，加入蒽酮試劑6 ml，按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法進行操作，于625 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖濃度C（μg/ ml），計算供試品中的多糖含量。

按照以下公式計算芡實多糖的得率：多糖得率（%）=供試品中的多糖含量（g）/芡實樣品的質(zhì)量（g）×100%。

1.3.3 酶解處理條件的優(yōu)化。分別以不同的纖維素酶用量、果膠酶用量、酶解時間、酶解溫度為單因素，考察其對芡實多糖提取效果的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖得率（%）為評價指標(biāo)，進行4因素3水平正交試驗，確定酶解的最優(yōu)條件。酶解處理正交試驗因素及水平設(shè)計見表1。

1.3.4 超聲處理條件的優(yōu)化。

以最佳酶解條件下得到的芡實多糖酶解液為基礎(chǔ)，分別以不同的料液比、超聲時間和超聲溫度為單因素，考察其對芡實多糖提取效果的影響。以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，以多糖得率（%）為評價指標(biāo)，進行3因素3水平的正交試驗，確定超聲處理的最優(yōu)條件。超聲處理正交試驗的因素及水平設(shè)計見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的確定

2.1.1 纖維素酶用量對多糖得率的影響。

從圖1可以看出，多糖得率隨著纖維素酶用量的增加而增加。當(dāng)纖維素酶用量達到2.0%時，多糖得率趨于穩(wěn)定，因此確定纖維素酶用量為2.0%。

2.1.2 果膠酶用量對多糖得率的影響。

從圖2可以看出，隨著果膠酶用量的增加，多糖得率逐漸提高。當(dāng)果膠酶用量為1.5%時多糖得率增加緩慢并趨于平衡，因此確定纖維素酶用量為1.5%。

2.1.3 酶解時間對多糖得率的影響。從圖3可以看出，芡實多糖得率隨著酶解時間的延長而增加，當(dāng)超過80 min時開始有所下降，可能是因為隨著酶解處理時間的過度延長，致使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此，確定80 min作為酶解時間。

2.1.4 酶解溫度對多糖得率的影響。

從圖4可以看出，芡實多糖得率隨著酶解溫度的提高呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)酶解溫度為35 ℃時，多糖得率達到最大，此后出現(xiàn)下降的趨勢。這可能與復(fù)合酶的最適作用溫度有關(guān)，溫度過高導(dǎo)致酶失活。因此，確定酶解溫度為35 ℃。

2.1.5 酶解處理正交試驗結(jié)果。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對超聲波協(xié)同果膠復(fù)合酶提取芡實多糖影響較大的酶解條件進行正交優(yōu)化試驗。由表3可知，酶法處理芡實對多糖得率影響因素的主次順序為：酶解溫度>酶解時間>纖維素酶用量>果膠酶用量，最佳水平組合為A1B1C2D2。酶解處理最優(yōu)條件為：添加纖維素酶1.5%、果膠酶1.0%，酶解時間80 min，酶解溫度35 ℃。

2.2 超聲處理條件的確定

2.2.1 料液比對多糖得率的影響。

從圖5可以看出，隨著料液比的增加，多糖得率逐漸提高，說明料液比的增加，有利于多糖得率的提高。當(dāng)料液比超過1∶15時，多糖得率趨于穩(wěn)定，但綜合考慮成本及后續(xù)處理工序，進一步試驗選擇用料液比1∶10。

2.2.2 超聲時間對多糖得率的影響。從圖6可以看出，隨著超聲時間的增加，多糖的得率逐漸增加。當(dāng)浸提時間達到1.5 h時，多糖得率趨于穩(wěn)定，因此浸提時間以1.5 h左右為宜。

2.2.3 超聲溫度對多糖得率的影響。從圖7可以看出，隨著超聲溫度的升高，多糖得率呈上升趨勢，當(dāng)超聲溫度在60 ℃以上時多糖得率趨于平穩(wěn)，多糖得率增加不顯著。但是，當(dāng)超聲溫度為80 ℃時，由于溫度太高導(dǎo)致芡實里的淀粉糊化，很難分離出清液，吸光度也相應(yīng)增大很多。綜合考慮，選擇60 ℃作為提取溫度。

2.2.4 超聲處理正交試驗結(jié)果。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對超聲波協(xié)同果膠復(fù)合酶提取芡實多糖影響較大的超聲條件進行正交優(yōu)化試驗。由表4可知，超聲溫度對超聲提取芡實多糖的提取效果影響最為明顯，其影響順序為超聲溫度>料液比>超聲時間。最優(yōu)超聲處理條件為A2B2C2，即料液比1∶10、超聲溫度60 ℃、提取時間1.5 h。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗，確定了超聲波復(fù)合酶法提取芡實多糖的最佳工藝條件為：添加1.5%纖維素酶、1.0%果膠酶，在35 ℃條件下酶解80 min；以1∶10的料液比在60 ℃下超聲提取1.5 h，此時多糖得率達到12.38%。超聲波的空化效應(yīng)能增加對原料的破碎效果，增加多糖溶出率，但它對細胞壁的破碎不完全；而復(fù)合酶的加入彌補了這一缺陷，使多糖的溶出幾率加大。該工藝簡單可行，對工業(yè)化生產(chǎn)芡實多糖具有指導(dǎo)意義。