劉楊，包華音，張峰

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濟(jì)南250100）

不同產(chǎn)地及品種金銀花中綠原酸和木犀草苷含量測(cè)定

劉楊1，包華音1，張峰2，*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濟(jì)南250100）

測(cè)定不同產(chǎn)地、品種金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量。按照2010年版《中國(guó)藥典》金銀花項(xiàng)下規(guī)定的HPLC法分別測(cè)定各樣品中綠原酸和木犀草苷的含量。結(jié)果表明13個(gè)不同產(chǎn)地來(lái)源、品種的金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量分別在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范圍內(nèi)，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。山東平邑來(lái)源金銀花的綠原酸和木犀草苷含量明顯高于其它產(chǎn)地，其中，以平邑地產(chǎn)金銀花質(zhì)佳。結(jié)論：不同產(chǎn)地來(lái)源、品種的金銀花質(zhì)量有一定差異，在引種栽培時(shí)應(yīng)選擇優(yōu)良品種。本研究結(jié)果可為金銀花引種栽培和人工培育提供參考依據(jù)。

金銀花；綠原酸；木犀草苷；HPLC；含量測(cè)定

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，味甘性寒，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效，主要用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱等癥的治療［1］。研究表明，有機(jī)酸類和黃酮類化合物為金銀花的主要有效成分［2］，具有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、解熱抗炎、保肝利膽、抗氧化等多種藥理作用［3-5］。2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定以綠原酸和木犀草苷作為金銀花的質(zhì)控成分。本研究通過(guò)HPLC方法測(cè)定不同產(chǎn)地來(lái)源、不同品種的金銀花栽培品中綠原酸和木犀草苷的含量，以期篩選出章丘龍山基地生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)金銀花種質(zhì)資源，為金銀花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1 儀器

日立L-2000高效液相色譜儀（安捷倫進(jìn)樣器、L-2400紫外檢測(cè)器、D-2000elite色譜工作站）；Sartorius CP225D電子天平（d=0.01mg）；數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱：上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超聲清洗儀：昆山市超聲清洗有限公司；Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；DIKMA苯基硅烷鍵合硅膠柱（Inertsil PH-3，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試劑

甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：T20111220）；甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純，批號(hào)：T20110727）；娃哈哈純凈水；乙腈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純，批號(hào)：20120206）；綠原酸（MUST-12031401）；木犀草苷（MUST-12041703）。

1.3 藥材

藥材于2013年5月23日采自山東省濟(jì)南市章丘龍山基地，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系李峰教授鑒定為金銀花。藥材詳細(xì)信息見(jiàn)表1。將藥材干燥后粉碎，過(guò)四號(hào)篩，備用。

2方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

綠原酸色譜條件：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；流速1 mL/min，柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20 μL，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1000。

表1 不同產(chǎn)地及品種的金銀花藥材Table 1Lonicera japonica of different habitats and kinds

木犀草苷色譜條件：苯基柱（InertsilPH-3，250mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，以0.5%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，按下列條件進(jìn)行梯度洗脫：0 min～15 min，A（10%～20%），B（90%～80%）；15 min～30 min，A（20%），B（80%）；30 min～40 min，A（20%～30%），B（80%～70%）。檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，流速1 mL/min，柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20 μL，理論板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于20 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取一定量的綠原酸和木犀草苷對(duì)照品置于10 mL棕色容量瓶中，綠原酸對(duì)照品加入一定量50%甲醇使溶解，木犀草苷對(duì)照品加入70%乙醇使溶解，超聲一段時(shí)間，然后再用各自的溶劑補(bǔ)足至刻度，搖勻，最后制成綠原酸40 μg/mL，木犀草苷40 μg/mL作為對(duì)照品溶液。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）和木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品（B）的HPLC圖譜Fig.1HPLC chromatogram of chlorogenic acid standard（A）and luteoloside standard（B）

2.3 供試品溶液的制備

綠原酸供試品溶液的制備：精密稱定藥材粉末0.25 g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，稱重并用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

圖2 綠原酸供試品（C）和木犀草苷供試品（D）的HPLC圖譜Fig.2HPLC chromatogram of chlorogenic acid sample（C）and luteoloside sample（D）

木犀草苷供試品溶液的制備：精密稱定藥材粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定重量，超聲提取1 h，稱重并用70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)?0%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制濃度分別為10、20、32、40、80、100 μg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液，按“2.1”色譜條件測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=2 937.4X-147.89（r=0.99 98），綠原酸濃度在10 μg/mL～160 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制濃度分別為10、30、40、50、60、80μg/mL的木犀草苷對(duì)照品溶液，按“2.1”色譜條件測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=2.8×106X-22 845（r=0.999 7），木犀草苷的濃度在10 μg/mL～80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2”中配制的木犀草苷和綠原酸的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，測(cè)定峰面積。計(jì)算其保留時(shí)間的RSD值分別為0.58%和0.71%，峰面積的RSD值分別為1.68%和0.31%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取9號(hào)樣品的木犀草苷供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，每次20 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別為1.26%、1.68%。取10號(hào)樣品的綠原酸供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，每次20 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別為1.29%、1.96%。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取8號(hào)樣品的木犀草苷供試品溶液，13號(hào)樣品的綠原酸的供試品溶液，分別進(jìn)樣6次，每次20 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果保留時(shí)間RSD值分別為1.23%、0.52%，峰面積RSD值分別為1.76%、1.27%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)知木犀草苷和綠原酸含量的樣品6份，精密稱定，再準(zhǔn)確加入一定量的木犀草苷和綠原酸的對(duì)照品，加入相應(yīng)的溶劑，按照“2.3”中的方法提取并測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 綠原酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2The recovery test results of chlorogenic acid（n=6）

表3 木犀草苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3The recovery test results of luteoloside（n=6）

2.9 綠原酸和木犀草苷的含量測(cè)定

對(duì)下列13個(gè)不同產(chǎn)地和品種的金銀花藥材分別按照“2.3”方法提取綠原酸、木犀草苷供試品溶液，按照“2.1”中的色譜條件，測(cè)定樣品中綠原酸和木犀草苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同產(chǎn)地、品種金銀花栽培品綠原酸、木犀草苷的含量測(cè)定Table 4Chlorogenic acid and luteoloside content determination of Lonicera japonica of different habitats and kinds

3討論

2010年版《中國(guó)藥典》金銀花項(xiàng)下規(guī)定按干燥品計(jì)，含綠原酸不得低于1.5%，含木犀草苷不得低于0.050%。本研究中不同產(chǎn)地來(lái)源和品種的金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量分別在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范圍內(nèi)，均顯著高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，均為質(zhì)優(yōu)的藥材。

本研究中，以綠原酸的含量為指標(biāo)計(jì)算，13號(hào)平邑金銀花含量最高，其次是平邑地產(chǎn)金銀花（7號(hào)）和平邑大毛金銀花（6號(hào)）產(chǎn)的金銀花。以木犀草苷含量為指標(biāo)計(jì)算，7號(hào)平邑地產(chǎn)金銀花含量最高，其次是平邑樹(shù)型金銀花（8號(hào)）、平邑雞爪花（10號(hào)）、平邑四季金銀花（9號(hào)）。山東和河南是金銀花的主產(chǎn)地，通常認(rèn)為金銀花以山東產(chǎn)量大，而以河南品質(zhì)佳［6］。但從本研究結(jié)果可見(jiàn)，山東平邑來(lái)源的金銀花質(zhì)量明顯優(yōu)于其它產(chǎn)地。

金銀花是臨床常用中藥材和藥食同源中藥，有著光明的開(kāi)發(fā)前景，市場(chǎng)潛力巨大，已由單一藥用向飲料、保健食品、日用化工等領(lǐng)域發(fā)展。金銀花的品質(zhì)受到生長(zhǎng)環(huán)境、栽培技術(shù)、采收季節(jié)、加工方法、儲(chǔ)存條件等多種因素的影響［7］。此外，金銀花原植物的種內(nèi)變異很大，在植物形態(tài)、有效成分含量等方面有較明顯的差異［8］。本研究統(tǒng)一選取濟(jì)南市章丘龍山基地生長(zhǎng)的金銀花，其中，以平邑地產(chǎn)金銀花的綠原酸和木犀草苷含量較高，因此，可初步確定山東平邑地產(chǎn)金銀花質(zhì)佳。可見(jiàn)，不同栽培品種的金銀花質(zhì)量有一定差異，所以在引種時(shí)應(yīng)考慮優(yōu)良品種。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：205

［2］邢俊波，李會(huì)軍，李萍，等.忍冬花蕾化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)新藥雜志，2002，11（11）：856

［3］王力川.金銀花的化學(xué)成分及功效研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（5）：2036-2037

［4］夏遠(yuǎn)，李弟灶，裴振昭，等.金銀花化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012，14（4）：26-32

［5］關(guān)炳峰，譚軍，周志娣.金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關(guān)性研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（10）：127-129

［6］王天志.金銀花的研究進(jìn)展［J］.華西藥學(xué)雜志，2000，15（4）：292

［7］李紅霞，王雪芹，李振國(guó)，等.不同產(chǎn)地金銀花與山銀花主要成分的含量比較［J］.中國(guó)藥房，2011，22（31）：2935-2937

［8］宋平順，衛(wèi)玉玲，陶耀武，等.不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的HPLC法測(cè)定［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（5）：31-34

Determination of Chlorogenic Acid and Galuteolin in Lonicera japonica of Different Kinds and Sources by HPLC

LIU Yang1，BAO Hua-yin1，ZHANG feng2，*
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan 250355，Shandong，China；2.Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100，Shandong，China）

To determine the content of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica of different kinds and sources.The content of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica were determined by HPLC according to the Chinese pharmacopoeia ordains.The contents of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica of different kinds and sources were 2.23%-3.16%and 0.085%-0.193%respectively，which were allaccordance with pharmacopeia's standard.The quality of Lonicera japonica from Shandong pingyi was obviously superior to other habitats，and that of Pingyi dichan was the best.There was difference in the quality of Lonicera japonica of different kinds and sources.The study provides

for artificial cultivation and quality evaluation of Lonicera japonica.

Lonicera japonica；chlorogenic acid；luteoloside；HPLC；content determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.030

2013-12-23

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目（2011LZ01-03）

劉楊（1981—），女（漢），本科，研究方向：中藥資源與質(zhì)量控制。

*通信作者：張鋒（1979—），女，副研究員，博士，從事藥用植物育種與栽培研究。