江毅敏　戴俊臣　王　俊　王顯飛　馮志松　賀國(guó)斌任　權(quán)

Kiss-1和MMP-9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

江毅敏1戴俊臣2王俊1王顯飛1馮志松1賀國(guó)斌1任權(quán)1

目的探討Kiss-1 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。方法選擇110例大腸癌和距瘤體5 cm以上的正常結(jié)直腸組織，用Realtime PCR檢測(cè)腸黏膜Kiss-1 mRNA和MMP9 mRNA的表達(dá)，用免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡檢測(cè)Kiss-1和MMP9蛋白的表達(dá)。結(jié)果結(jié)直腸癌組織中Kiss-1 mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁組織；結(jié)直腸癌組織中MMP9 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P=0.001）。Kiss-1蛋白在結(jié)直腸腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著低于癌旁組織（P＜0.05）；結(jié)直腸癌組織中MMP9蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。KISS-1表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論Kiss-1蛋白表達(dá)缺失與大腸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)可做為大腸癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子及大腸癌的治療靶點(diǎn)，對(duì)于結(jié)直腸癌的防治具有重要的臨床意義。

結(jié)直腸癌；Kiss-1；MMP-9；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

大腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，其原因主要是大腸癌患者早期可無(wú)癥狀或早期癥狀不明顯，腫瘤局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高［1］，因此如何早期發(fā)現(xiàn)和抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。定期結(jié)腸鏡檢查有益于防治早期大腸癌。而Kiss-1基因是新近發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。本研究通過(guò)檢測(cè)大腸癌組織、癌旁組織（距腫瘤5 cm）腸黏膜組織中Kiss-1基因及其蛋白表達(dá)，并分析其與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及臨床意義。

資料與方法

一、臨床資料和主要試劑

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科2013年3月至2014年12月手術(shù)切除的110例新鮮結(jié)直腸癌瘤體及距瘤體5 cm以上的正常結(jié)直腸組織標(biāo)本，液氮保存。入選病例術(shù)前均經(jīng)腸鏡檢查及活檢的病理確診且未行放、化療。年齡20～75歲，平均年齡（55.46±9.86）歲；其中男性57例，女性53例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例。主要試劑：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtime PCR）試劑盒購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，Kiss-1基因引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司設(shè)計(jì)及合成，見(jiàn)表1。Kiss-1多克隆杭體購(gòu)于美國(guó)abcam公司。

表1　Kiss-1 Real-time PCR引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及退火溫度

二、Real-time PCR檢測(cè)腸黏膜Kiss-1 mRNA表達(dá)

應(yīng)用Trizol法提取組織RNA，用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度和純度，取A260/A280比值為1.9～2.2的樣品，按照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20℃保存。反應(yīng)體系25 μL（cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，2x SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，dH2O 8.5 μL）。反應(yīng)程序：95℃、10 s，95℃、5 s，60℃、20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取3份正常結(jié)直腸組織總RNA等體積混合作為正常對(duì)照樣品。用相對(duì)定量方法計(jì)算Kiss-1基因mRNA的表達(dá)量。公式：RQ=2-△△Ct，△△Ct=△Ct待測(cè)－△Ct正常=（Ct待測(cè)－Ctβ-actin）－（Ct正常－Ctβ-actin）。

三、免疫組化檢測(cè)腸黏膜Kiss-1蛋白表達(dá)

抗Kiss-1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，抗MMP-9抗體購(gòu)自Abnova公司。石蠟切片脫蠟和水化，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，常規(guī)封閉后滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBS振蕩清洗后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠常規(guī)封片。采用雙盲法觀察切片，半定量積分法判斷免疫組化結(jié)果［2］：凡腸黏膜腺體細(xì)胞漿著色者為陽(yáng)性，根據(jù)染色強(qiáng)度和顯色細(xì)胞的比例進(jìn)行綜合評(píng)分。每張切片隨機(jī)選取8個(gè)高倍視野（400倍）進(jìn)行評(píng)分。①按組織顯色深淺評(píng)分：無(wú)顯色者為0分，呈淺黃色或黃色者為1分，呈棕黃色者為2分，呈棕褐色者為3分，求出8個(gè)視野的平均分。②以細(xì)胞著色比例分級(jí)為：＜25%的細(xì)胞著色，計(jì)0.1分；26%～50%的細(xì)胞著色，計(jì)0.4分；51%～75%的細(xì)胞著色，計(jì)0.6分；76%～100%的細(xì)胞著色，計(jì)0.9分；求出8個(gè)視野的平均分。③每張切片的積分為①×②。

圖1　免疫組化檢測(cè)

四、蛋白免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)腸黏膜Kiss-1蛋白表達(dá)

檢測(cè)提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定濃度，以80 μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE（5%濃縮膠，10%分離膠）分離電泳，溴酚蘭到達(dá)分離膠底部時(shí)終止電泳。20 mA恒流條件轉(zhuǎn)膜1 h，使蛋白轉(zhuǎn)移至0.1 nm的NC膜上，膜在5%脫脂奶粉溶液中常溫孵育2 h以封閉非特異性抗原，TBST清洗，加入一抗（1：200兔抗人Kiss-1多克隆抗體），4℃孵育過(guò)夜。TBST清洗，加入二抗（1：500羊抗兔IgG），常溫孵育2 h。TBST清洗后用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影曝光，用GIS1000軟件分析系統(tǒng)量化分析。蛋白表達(dá)量=Kiss-1灰度值/β-actin灰度值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Real-time PCR結(jié)果

結(jié)直腸癌組織中Kiss-1 mRNA表達(dá)水平（0.242±0.13）顯著低于癌旁組織（0.573±0.41），P=0.035；結(jié)直腸癌組織中MMP9 mRNA表達(dá)水平（0.651±0.36）顯著高于癌旁組織（0.189±0.41），P=0.001。

二、免疫組化結(jié)果

正常結(jié)直腸組織中Kiss-1免疫組化積分最高。Kiss-1蛋白在結(jié)直腸腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著低于癌旁組織（P =0.043）；癌旁組織中MMP9表達(dá)量很低，結(jié)直腸癌組織中MMP9陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁組織（P=0.035），見(jiàn)圖1。

三、蛋白免疫印跡結(jié)果

正常結(jié)直腸組織中Kiss-1蛋白表達(dá)最高。Kiss-1蛋白在結(jié)直腸腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著低于癌旁組織（P= 0.039）；結(jié)直腸癌組織中MMP9陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁組織（P=0.001），見(jiàn)圖2。

圖2　蛋白免疫印跡檢測(cè)

四、Kiss-1與結(jié)直腸腫瘤臨床特征的關(guān)系

Kiss-1mRNA及蛋白表達(dá)情況與結(jié)直腸腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

討論

Kiss-1［3］基因是一個(gè)新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，于1997年在黑色素瘤中被Lee等人首次發(fā)現(xiàn)。KiSS-1在包括心臟、肝臟、腎臟和胰腺等多種正常組織中表達(dá)，而在多種存在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)缺失，表明它是一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］。Lee等［5］研究表明：Kiss-1基因不影響成瘤特性，但能夠抑制95%的腫瘤轉(zhuǎn)移。先后有報(bào)道Kiss-1基因在乳腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、前列腺癌等腫瘤中有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，并在判斷腫瘤患者預(yù)后上具有一定的價(jià)值［6-7］。何進(jìn)等［8］報(bào)道Kiss-1基因表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Kiss-1基因在大腸癌中的表達(dá)情況的報(bào)道較少。本研究表明：KISS-1 mRNA及蛋白表達(dá)一致，其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于正常結(jié)直腸組織（P＜0.05）。KISS-1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05），但與結(jié)直腸腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），即高分化腫瘤、浸潤(rùn)深，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者Kiss-1表達(dá)較高。

表2　不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者Kiss-1基因mRNA及蛋白表達(dá)水平

基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrixmetall oproteinases，MMPs）屬于Zn2+依賴性蛋白水解酶家族，能夠水解基底膜（BM）和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，且國(guó)外報(bào)道證實(shí)結(jié)腸直腸癌患者M(jìn)MP-9表達(dá)水平高者預(yù)后明顯低于表達(dá)水平低者［9-11］。據(jù)報(bào)道［12］：Kiss-1通過(guò)抑制NF-κBp65與基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9啟動(dòng)子結(jié)合而減少M(fèi)MP9合成，故Kiss-1基因?qū)MP-9表達(dá)呈負(fù)調(diào)控。本研究結(jié)果與既往研究類似：在結(jié)直腸癌組織中，MMP-9表達(dá)明顯高于正常黏膜組（P＜0.05）。

綜上所述，本研究表明了Kiss-1基因在浸潤(rùn)深、有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)減低，作為轉(zhuǎn)移抑制基因其表達(dá)減低提示其轉(zhuǎn)移趨勢(shì)及預(yù)后較差。同時(shí)其與MMP-9表達(dá)呈負(fù)調(diào)控關(guān)系（r=-0.407，P＜0.05）。Kiss-1、MMP-9在結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中具有重要作用，可做為大腸癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子及大腸癌的治療靶點(diǎn)，對(duì)于結(jié)直腸癌的防治具有重要的臨床意義。

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2015-03-04）

（本文編輯：陳燁）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.016

1 637000川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；2 637007川北醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院

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四川省教育廳科研項(xiàng)目（14ZB0201））