殷漢華　何雅軍　鄧延梅　潘立武　劉序友　韓馥縵　葉國榮　呂　霞　舒建昌

姜黃素對肝星狀細胞中髓樣分化因子88蛋白表達的影響

殷漢華1何雅軍2鄧延梅2潘立武2劉序友2韓馥縵2葉國榮2呂霞2舒建昌2

目的觀察姜黃素干預前后肝星狀細胞（HSC）中髓樣分化因子88（MyD88）蛋白的變化水平，以探討姜黃素抗肝纖維化的相關機制。方法構建pCMV-Myc-MyD88重組質粒，將人腎上皮細胞293T細胞及HSC-T6細胞分別設為空白對照組、MyD88過表達組、姜黃素+MyD88過表達組，其中MyD88過表達組給予轉染pCMV-Myc-MyD88重組質粒72 h，姜黃素+MyD88過表達組在轉染48 h后加入姜黃素繼續(xù)作用24 h。采用Western blot法檢測MyD88蛋白表達。結果①轉染pCMV-myc-MyD88重組質粒48 h后，MyD88在293T細胞及HSC中表達均明顯增高（P＜0.05），且經姜黃素處理后兩類細胞中表達量明顯降低（P＜0.05）。②姜黃素處理后MyD88表達量較MyD88質粒轉染組明顯降低（P＜0.05）。結論姜黃素可能通過抑制肝星狀細胞MyD88蛋白表達，阻斷MyD88依賴性信號通路的轉導而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

MyD88；姜黃素；肝星狀細胞

肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵細胞［1］。姜黃素是由中藥姜黃中提取的活性成分，是研究最多的天然化合物之一，具有廣泛的藥理作用，如誘導腫瘤細胞凋亡、抗氧化、清除氧自由基等［2-3］。我們前期的研究證實，姜黃素可以抑制HSC的活化增殖，使其停留在G2/M期，并誘導HSC凋亡，其作用具有時間和劑量依賴性［4-7］。Toll樣受體（TLRs）主要表達于巨噬細胞、HSC等，屬Ⅰ型跨膜蛋白，可通過MyD88依賴性和TRIF依賴性兩條途徑來傳導細胞活化信號，與肝臟炎癥損傷、肝纖維化發(fā)生發(fā)展有關［8-9］。本研究擬觀察髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）蛋白在姜黃素作用前后其在HSC中表達的改變，從而探討MyD88蛋白與姜黃素之間的關系，以進一步研究姜黃素的抗肝纖維化機制。

材料與方法

一、一般資料

1.細胞株

肝星狀細胞株HSC-T6是由上海中醫(yī)藥大學徐列明教授饋贈，其具有活化HSC的表型；293T細胞株購自中科院上海細胞生物學研究所。

2.試劑

兔抗大鼠MyD88一抗（美國Santa Cruz公司），姜黃素（美國Sigma公司），siRNA Transfection Reagent（美國Santa Cruz公司），β-Actin內參一抗（美國EarthOX公司），質粒小提試劑盒（DPl03）［（天根生化科技（北京）有限公司］，逆轉錄試劑盒（美國Abcam公司），PCR擴增試劑盒（美國Abcam公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液選用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2及飽和濕度，定期在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，根據生長狀態(tài)進行換液，當細胞生長至密度達到80%～90%時即開始準備進行傳代。

2.RT-PCR

將收集的細胞提取總RNA。參照逆轉錄試劑盒說明書行逆轉錄反應。取逆轉錄產物，根據Gen－Bank MyD88（No.AY191270.1）的功能編碼區(qū)序列和載體pCMV-Myc序列特點，選擇EcoRI-HF和KpnI作為酶內切位點，設計PCR引物序列如下：上游引物：5′-AAT TGA ATT CGG ATG TCT GCG GGA GGC CCC-3′，下游引物：5′-AAT TAA GGT ACC-TCA GGG CAG GGA CAG AGC-3′。參照PCR試劑盒說明書，獲取PCR產物，進行電泳。將瓊脂糖凝膠置于核酸/蛋白凝膠圖像成像分析儀采集圖像并保存。

3.構建重組質粒

影響企業(yè)生存和發(fā)展的因素還有企業(yè)創(chuàng)新。企業(yè)創(chuàng)新其實就是對商品使用價值的創(chuàng)新，即對商品有用性的創(chuàng)新，進一步講就是創(chuàng)有效勞動之新。如果不是對有效勞動創(chuàng)新，企業(yè)不斷重復的勞動可能就會變成無效勞動，生產的產品就是無用產品，產品銷售不出去，就不能實現商品價值，最終受損的是商品所有者。創(chuàng)新商品使用價值，提高產品性能，提升商品原有的有用性，增加產品多樣性，在市場上賣出更高的價格，從而獲得更好的收益。國家提出供給側結構性改革與創(chuàng)新使用價值在本質上是一致的。因此企業(yè)要想立于不敗之地成為行業(yè)領軍者，就要加強對使用價值的創(chuàng)新，不能抱殘守缺。

將酶切MyD88 DNA片段及載體質粒及DNA回收后，連接MyD88 DNA片段及載體質粒，經質粒轉化、篩選及質粒抽提后，重建質粒酶切鑒定及測序。

4.重建質粒轉染至細胞

HSC-T6及293T常規(guī)培養(yǎng)傳代，取對數生長期狀態(tài)良好的細胞消化計數，采用無雙抗培養(yǎng)基將細胞濃度稀釋至8×104/mL，取2 mL/孔種6孔板，37℃，5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分3組進行轉染：①空白對照組；②重組質粒組；③重組質粒組+姜黃素組。取6 μL siRNA Transfection Reagent加入92 μL不含血清的DMEM中，另取12 μg重組質粒加入88 μL不含血清的DMEM中，將兩者混合，輕輕吹打混勻，室溫孵育25 min，加入800 μL DMEM中混勻，加入到6孔板中培養(yǎng)培養(yǎng)細胞8 h，更換含10%胎牛血清的無雙抗培養(yǎng)液4 mL繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

5.Western bolt

收集各組細胞蛋白后，進行蛋白定量，配制SDS-PAG凝膠進行蛋白電泳，每孔上樣20～30 μL，樣本的兩側泳道加入預染的蛋白Markers作為指示參考。經轉膜后孵育一抗，MyD88抗體溶液、β-Actin抗體溶液，置于4℃下的搖床上孵育過夜。次日，用TBST液2～3次，10 min/次。二抗孵育2 h，再以TBST液清洗2～3次，每次10 min，取等體積的ECL發(fā)光劑A液、B液并混勻，顯影，設置曝光時間，采圖并保存結果。使用相配套的Image Lab分析軟件測定蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，所得數據均以x±s表示，多組數據間的比較采用單因素方差分析或獨立樣本T檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、Pcmv-Myc-MyD88重組質粒的構建與鑒定

二、MyD88在293T細胞中的表達及姜黃素對其表達的影響

Western blot檢測結果顯示，瞬時轉染pCMV-myc-MyD88重組質粒于293T細胞48 h后MyD88蛋白表達量較空白組明顯增高（1.462±0.276 vs 0.438±0.087），姜黃素處理后其表達量較MyD88質粒轉染組明顯降低（0.734±0.157 vs 1.462± 0.276）（圖1）。

圖1　姜黃素對293T細胞中MyD88表達的影響（*與空白組比較，P＜0.05；#與MyD88質粒轉染組比較，P＜0.05）

三、MyD88在HSC細胞中的表達及姜黃素對其表達影響

Western blot檢測結果顯示，瞬時轉染pCMV-myc-MyD88重組質粒48 h后MyD88蛋白表達量較空白組明顯增高（0.413±0.089 vs 0.847±0.131），姜黃素處理后其表達量較MyD88質粒轉染組明顯降低（0.847±0.131 vs 0.362±0.057）（圖2）。

圖2　姜黃素對肝星狀細胞中MyD88表達的影響（*與空白組比較，P＜0.05；#與MyD88質粒轉染組比較，P＜0.05）

討論

本研究通過構建pCMV-myc-MyD88重組質粒并轉染293T細胞及HSC-T6中使MyD88蛋白過表達，并以姜黃素干預前后檢測其蛋白表達量的變化，以觀察姜黃素對該蛋白表達的影響，從而確定姜黃素對HSC中MyD88依賴性信號通路的影響。

HSC活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。各種損傷因素通過不同方式和途徑作用于肝臟，引起肝細胞、庫弗細胞等損傷、壞死、凋亡及肝組織炎癥反應，釋放大量、多種細胞因子等，通過多種途徑激活HSC并轉化為肌成纖維樣細胞，大量合成和分泌膠原等細胞外基質，最終引起肝纖維化、肝硬化。

人及哺乳動物存在一個TLR家族，可以識別病原菌，激活導致機體有效防御基因的轉錄，從而啟動特異性和非特異性免疫反應抵抗病菌人侵。

Toll樣受體（TLRs）主要表達于巨噬細胞、HSC等，屬Ⅰ型跨膜蛋白，主要作用是識別不同的病原分子并發(fā)揮受體活化后的信號轉導作用，通過識別入侵病原微生物的配體，激發(fā)天然免疫應答，啟動促炎癥細胞因子和共刺激分子的表達，可增強細胞因子的合成與釋放能力并進而誘導炎癥反應，是機體介導天然免疫轉向獲得性免疫的橋梁，其可通過MyD88依賴性和TRIF依賴性途徑兩條途徑來傳導信號活化，與肝臟的炎癥損傷有關［8-9］。

TLRs的信號轉導途徑主要有兩條，MyD88依賴性和TRIF依賴性。TLR l、2、5、7、9和10是通過MyD88依賴性途徑。在MyD88依賴性途徑中，MyD88是信號轉導通路中的關鍵蛋白［10］。

肝臟組織內的實質細胞與非實質細胞中均可見TLR表達，如肝細胞表達TLR1-9，HSC表達TLR2與TLR4。在內毒素刺激下表達增加，同時活化細胞，通過細胞內信號轉導最終活化NF-資B并調控反應性基因的轉錄，合成并分泌大量致纖維化的細胞因子，如TGF-β、TNF-α、ICAM-1、IL-1、IL-2、IL-8和IL-12等。再次通過一系列途徑作用于成纖維細胞，促使其增殖并表達α-SMA，發(fā)生細胞表型的轉化，從而分化為肌成纖維細胞，合成和分泌膠原蛋白，導致過量的細胞外基質在肝臟內沉積而致肝纖維化［11-12］。腸源性內毒素（主要成分為LPS）入肝后，可激活庫普弗細胞，啟動TLR4信號通路，分泌TNF-a、IL-1β等細胞因子。人活性HSC表達TLR4、CD14，并能識別LPS而分泌致炎細胞因子。HSC能直接識別LPS及其他TLR配體，并促進纖維組織增生［13］。

293T細胞就是一種表達SV40病毒T抗原的細胞系，來源于人胚胎腎細胞293HEK，經改造后在其中插入了T抗原，用293T細胞進行轉染可以獲得較高的表達水平。293T細胞可用于篩選穩(wěn)定表達的細胞系。在本研究中293T細胞用于檢測轉染效率并作為對照組。結果發(fā)現將pCMV-myc-MyD88重組質粒并轉染HSC-T6及293T后MyD88蛋白表達量明顯增加（P＜0.05），予以姜黃素作用后檢測MyD88蛋白表達量下降（P＜0.05），說明姜黃素可以降低MyD88蛋白的表達，從而抑制MyD88依賴性信號通路，進而抑制HSC的活化、增生等，這可能是姜黃素發(fā)揮抗肝纖維的作用的機制之一，具體的分子機制需進一步研究。

本研究從姜黃素與MyD88的關系入手，發(fā)現姜黃素可抑制MyD88蛋白表達，可能是姜黃素抗肝纖維的作用機制之一，并且有助于進一步探討將TLRs和MyD88蛋白作為早期診斷肝纖維化的指標，或作為治療肝纖維化的靶點之一。

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Effects of curcumin on the expression of myeloid differentiation factor 88 protein in hepatic stellate cells

YIN Han-ping1，HE Ya-jun2，DENG Yan-mei2，PAN Li-wu2，LIU Xu-you2，HAN Fu-man2，YE Guo-rong2，LV Xia2，SHU Jian-chang2.
1）Heyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine；
2）Department of Gastroenterology，The Fourth Affiliated Hospital of the Medical College of Jinan Uiversity/Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220

Objective To observe the expression difference of myeloid differentiation factor 88（MyD88）protein in hepatic stellate cell（HSC）treated with curcumin，and to investigate the related mechanism of the anti-fibrotic effect of curcumin.Methods 293T cell and HSC cell were individually divided into control group，vector of MyD88 plasmid group，and curcumin+vectors of MyD88 plasmid group.The expression of MyD88 was detected by Western blot.Results①After transfection of pCMV-Myc-MyD88，the expression of MyD88 was significantly increased（P＜0.05），while the expression of MyD88 in curcumin+vectors of MyD88 plasmid group was significantly decreased than vectors of MyD88 plasmid group（P＜0.05）.②After transfection of pCMV-Myc-MyD88 HSC，the expression of MyD88 was significantly increased（P＜0.05）.The expression of MyD88 in curcumin+vectors of MyD88 plasmid group was significantly decreased compared with vectors of MyD88 plasmid group（P＜0.05）.Conclusions Curcumin might prevent liver fibrosis by inhabiting the expression of MyD88 protein and blocking MyD88-dependent signaling pathway.

MyD88；Curcumin；Hepatic stellate cells

2014-11-24）

（本文編輯：白嵐）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.007

1 517000廣東省河源市中醫(yī)院；2 510220暨南大學醫(yī)學院附屬第四醫(yī)院/廣州市紅十字會醫(yī)院

舒建昌，E-mail：shujc62@hotmail.com

廣東省科技計劃項目（20120318023），廣東省科技計劃項目（2020314），中國肝炎防治基金會王寶恩肝纖維化研究基金項目（CFHPC20131014）