揭　晶，孫桂芝，劉冬琳，張勇鋼

（武漢生物工程學(xué)院制藥工程系，湖北武漢430415）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取蘆筍總皂苷

揭晶，孫桂芝，劉冬琳，張勇鋼*

（武漢生物工程學(xué)院制藥工程系，湖北武漢430415）

利用響應(yīng)面法對超聲提取蘆筍總皂苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)研究了超聲條件下影響蘆筍總皂苷得率的因素，包括乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，得出了超聲提取蘆筍總皂苷的最佳工藝條件為：料液比1∶15（W/V），乙醇濃度74%，超聲時(shí)間54min，超聲溫度50℃，此時(shí)蘆筍總皂苷得率為13.06%，接近于模型預(yù)測值13.18%。

響應(yīng)面法，超聲提取，蘆筍，總皂苷

蘆筍系百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物，是世界十大名菜之一，質(zhì)地鮮嫩，享有“蔬菜之王”的美稱［1-2］?，F(xiàn)代研究表明，其主要成分為甾體皂苷類，具有較強(qiáng)的生理和藥理活性，包括抗腫瘤、降血脂、抗衰老、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等作用［3-4］。

目前對蘆筍總皂苷提取進(jìn)行研究的方法主要有兩種，即溶劑浸提法［5-6］和超聲波輔助提取法［7-9］。溶劑浸提法提取時(shí)間長、操作繁瑣。超聲提取技術(shù)作為一種中藥提取的新技術(shù)，具有省時(shí)、高效、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，其在中藥提取工藝中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。已有報(bào)道［10］采用這兩種方法對蘆筍老莖中皂苷進(jìn)行提取，結(jié)果表明超聲法比浸提法的提取量提高了29.3%。本研究于國內(nèi)首次采用較高超聲功率（600W）對蘆筍總皂苷進(jìn)行提取，以總皂苷得率為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選蘆筍總皂苷的最佳提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘆筍武漢新辰食品有限公司提供的新鮮蘆筍莖，由武漢生物工程學(xué)院制藥工程系生藥教研室殷丹博士鑒定，洗凈切段晾干，于60℃烘干，粉碎過60目篩，備用；菝葜皂苷元對照品國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度98%，批號20100710；乙醇、甲醇、高氯酸國產(chǎn)分析純；蒸餾水。

HN22-600C型超聲波清洗機(jī)上海汗諾儀器有限公司；HHS4S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海光地儀器設(shè)備有限公司；TU-1810型紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ZBY-26型商用制冰機(jī)江蘇白雪電器股份有限公司；BS124S型電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用高氯酸法［7］。蘆筍中的甾體皂苷類化合物是抗癌的主要成分，其水解產(chǎn)物是菝葜皂苷元［11］，所以選擇菝葜皂苷元作為對照品。由于菝葜皂苷元沒有紫外吸收，所以選擇高氯酸作為顯色劑，間接測定蘆筍總皂苷的含量。準(zhǔn)確稱取菝葜皂苷元對照品5mg，置于10m L容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，備用。精密吸取對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7m L，置于10m L具塞試管中，水浴揮干溶劑，加高氯酸5m L，搖勻，65℃水浴15min，取出后于冰水浴中冷卻5m in，于311nm處測定吸收度。

1.2.2蘆筍總皂苷的提取及測定精密稱取2g蘆筍粉末，置于250m L錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇適量，控制超聲功率600W，超聲頻率40kHz，在一定的溫度條件下超聲提取。然后將粗提液置于500m L圓底燒瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用甲醇溶解，過濾，所得濾液以甲醇定容至100m L，備用。吸取蘆筍總皂苷提取液0.1m L置于10m L具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，測定其吸收度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總皂苷含量，并代入下列公式求出總皂苷得率。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以總皂苷得率為評價(jià)指標(biāo)，固定乙醇濃度70%、料液比1∶15（g/m L）、超聲時(shí)間50m in、超聲溫度50℃，考察不同的乙醇濃度（40%～90%）、料液比（1∶10～1∶35）、超聲時(shí)間（10～60min）、超聲溫度（40～80℃）對蘆筍總皂苷得率的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn)選出對蘆筍總皂苷得率具有顯著影響的因素，并確定其實(shí)驗(yàn)水平值。

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇影響蘆筍總皂苷得率（Y）的3個(gè)主要影響因素：乙醇濃度（X1）、超聲時(shí)間（X2）、超聲溫度（X3）進(jìn)行組合，以-1、0、1代表因素水平，實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼見表1。

表1　Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1　Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式方程。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以菝葜皂苷元質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，得回歸方程y=0.0022x+ 0.0277，R2=0.9982，結(jié)果表明在102～357μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1乙醇濃度的影響由圖2可知，蘆筍總皂苷得率在乙醇濃度為70%時(shí)最高。乙醇濃度小于70%時(shí)總皂苷得率隨濃度的升高而升高，在60%后上升較快，這是因?yàn)楦邼舛纫掖加欣诖既苄缘脑碥疹愇镔|(zhì)溶出。乙醇濃度超過70%后總皂苷得率隨乙醇濃度的升高反而降低，這是因?yàn)殓摅w皂苷易溶于稀醇，過高濃度的乙醇不利于甾體皂苷類物質(zhì)溶出。因此乙醇濃度選取70%為宜。

圖1　菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of Sarsasapogenin

圖2　乙醇濃度對總皂苷得率的影響Fig.2　Influence of ethanol concentration on the extraction yield

2.2.2料液比的影響由圖3可知，料液比1∶15之前，總皂苷得率隨著料液比的增加而增加，這是因?yàn)槿軇┝吭龃笫沟每傇碥杖艹隽吭黾?。料液比超過1∶15后，總皂苷得率略有下降，可能是其他雜質(zhì)成分競爭性溶出不利于皂苷提取?？傮w趨勢變化不大，由此可知料液比在1∶10～1∶35范圍內(nèi)對蘆筍總皂苷得率影響不顯著。因此料液比選取1∶15為宜。

圖3　料液比對總皂苷得率的影響Fig.3　Influence of solid-liquid ratio on the extraction yield

2.2.3超聲時(shí)間的影響由圖4可以看出在10～50m in范圍內(nèi)，總皂苷得率隨著時(shí)間延長而不斷增加，50m in后呈現(xiàn)下降趨勢。這是因?yàn)?0m in時(shí)，蘆筍總皂苷提取液達(dá)到平衡，此時(shí)總皂苷得率最高。提取時(shí)間繼續(xù)延長會(huì)增加雜質(zhì)成分的溶出，得率反而降低。因此超聲時(shí)間選取50m in為宜。

圖4　超聲時(shí)間對總皂苷得率的影響Fig.4　Influence of ultrasonic time on the extraction yield

2.2.4超聲溫度的影響由圖5可以看出在低溫下，蘆筍總皂苷溶出較慢，當(dāng)溫度逐漸增大時(shí)，總皂苷隨之溶出加快；當(dāng)溫度超過50℃后，總皂苷的含量反而減少，可能是由于高溫促使皂苷成分分解，使得皂苷成分被破壞，含量下降。因此超聲溫度選取50℃為宜。

圖5　超聲溫度對總皂苷得率的影響Fig.5　Influence ofultrasonic temperature on the extraction yield

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化蘆筍總皂苷提取工藝

2.3.1響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到料液比在1∶10～1∶35范圍內(nèi)對蘆筍總皂苷得率影響不顯著，所以選取乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)因素，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2　Projects and results of response surface experiments

2.3.2擬合回歸方程的建立采用Design Expert 8.0軟件對各因素進(jìn)行多元線性回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=12.78-0.98X1+0.51X2-0.015X3-0.17X1X2+0.10X1X3-0.08X2X3-0.82X12-0.86X22-1.23X32?；貧w方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3　回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3　Analysis results of response surface experiments

從表3可以看出整體模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），一次項(xiàng)X1、X2和二次項(xiàng)X12、X22、X32均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），表明實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。由表3知失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），表明該方程對實(shí)驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小。回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9860，表明模型擬合程度良好，可用該模型對未知條件下總皂苷得率進(jìn)行預(yù)測。該模型的變異系數(shù)（C.V.%）為1.92%，在可接受范圍內(nèi)，其值越小，重復(fù)性越好。由F值的大小可以推斷，在所選擇的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對總皂苷得率的影響程度大小順序依次為：乙醇濃度（X1）＞超聲時(shí)間（X2）＞超聲溫度（X3）。

2.3.3響應(yīng)曲面分析響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各實(shí)驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可以找出最佳參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用。采用Design Expert 8.0軟件處理后的三維響應(yīng)面圖見圖6～圖8。

從圖6可以看出，固定乙醇濃度不變，隨著超聲時(shí)間的延長總皂苷得率增大，超聲時(shí)間為53m in時(shí)，總皂苷得率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長時(shí)間則得率反而降低。固定超聲時(shí)間不變，隨著乙醇濃度的增加，提取率呈先增加后降低的趨勢。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)楦邼舛纫掖己烷L時(shí)間超聲使得樣品中的雜質(zhì)競爭性溶出，導(dǎo)致皂苷的溶出量降低。乙醇濃度對響應(yīng)值的影響大于提取時(shí)間。

圖6　乙醇濃度和超聲時(shí)間交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.6　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of total saponins

由圖7可以看出，固定乙醇濃度不變，隨著超聲溫度的升高，總皂苷得率先增加后降低，當(dāng)超聲溫度為50℃，總皂苷得率達(dá)到最大值。固定超聲溫度不變，隨著乙醇濃度的增加，提取率呈先增加后降低的趨勢。乙醇濃度對響應(yīng)值的影響大于超聲溫度。

圖7　乙醇濃度和超聲溫度交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.7　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of total saponins

由圖8可知，超聲時(shí)間和超聲溫度之間交互作用不顯著。隨著超聲時(shí)間的延長，總皂苷得率先增加后降低，當(dāng)超聲時(shí)間為53m in時(shí)，總皂苷得率達(dá)到最大值。隨著超聲溫度的升高，總皂苷得率先增加后降低，當(dāng)超聲溫度為50℃時(shí)，總皂苷得率達(dá)到最大值。這是因?yàn)槌晻r(shí)間適當(dāng)延長、超聲溫度適當(dāng)升高是有利于皂苷成分溶出，但超聲時(shí)間過長、超聲溫度過高，雜質(zhì)成分大量溶出導(dǎo)致總皂苷得率反而降低。

圖8　超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.8　Response surface of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of total saponins

2.3.4皂苷最佳提取條件的確定和驗(yàn)證通過軟件對回歸方程進(jìn)行分析處理，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇濃度73.69%，超聲時(shí)間53.63min，超聲溫度49.56℃。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，在優(yōu)化條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次?？紤]到實(shí)際操作的可行性，實(shí)際操作中取值為乙醇濃度74%，超聲時(shí)間54min，超聲溫度50℃。三組總皂苷得率分別為12.89%、13.12%、13.17%，平均值為13.06%（RSD=1.49%），實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值（13.18%）非常接近，表明所建立的模型具有良好的預(yù)測性，優(yōu)選的工藝條件重復(fù)性良好。

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Design Expert軟件采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對蘆筍總皂苷提取工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)并優(yōu)化。研究結(jié)果表明乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度對蘆筍總皂苷得率的影響不是簡單的線性關(guān)系。在超聲功率600W，超聲頻率40kHz，料液比為1∶15的條件下，本實(shí)驗(yàn)確定了超聲法提取蘆筍總皂苷最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度74%，超聲時(shí)間54m in，超聲溫度50℃，蘆筍總皂苷得率為13.06%。說明該模型可以較好的預(yù)測蘆筍總皂苷提取條件與得率之間的關(guān)系，同時(shí)也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化蘆筍總皂苷的提取工藝參數(shù)的可行性。

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Optim ization ultrasonic extraction process of totalsaponins from Asparagus officinalis L.by response surface methodology

JIE Jing，SUN Gui-zhi，LIU Dong-lin，ZHANG Yong-gang*
（Departmentof Pharmaceutical Engineering，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China）

To op tim ize the ultrasonic extraction technique for the total saponins from Asparagus officinalis L.by response surface methodology.The effect fac tors on the yield of total saponins from Asparagus officinalis L. were stud ied w ith ultrasonic cond ition，inc lud ing ethanol concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic time，ultrasonictem perature.Theop tim izedextractionp rocesswasfoundthroughtheresponsesurface methodology.Accord ing to the p rincip le of central composite design w ith the response surface methodology of three factors and three levels，the op timum ultrasound extraction technology was as follow ing：solid-liquid ratio 1∶15（W/V），74%ethanol，ultrasonic time 54m in，ultrasonic tem perature 50℃.Under the conditions，the extraction yield of the total saponins of Asparagus officinalis L.was 13.06%，which was wellmatched w ith the p red ictive extraction yield 13.18%.

response surface methodology；ultrasound extraction；Asparagus officinalis L.；totalsaponins

TS255.1

B

1002-0306（2015）06-0309-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.059

2013-11-25

揭晶（1980-），女，碩士研究生，講師，研究方向：中藥提取和中藥制劑。

張勇鋼（1979-），男，碩士，講師，研究方向：中藥制劑研究。

2013國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31302144）；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012FFB05201）；2012年度湖北省高等學(xué)校青年教師深入企業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（XD2012501）。