劉晶晶，王　燁，韓曜平，王雪鋒，戴陽(yáng)軍

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性研究

劉晶晶，王燁，韓曜平，王雪鋒，戴陽(yáng)軍

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

以河蜆抗氧化肽清除羥自由基的活性變化為指標(biāo)，研究溫度、pH、食品原料、防腐劑和不同金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：河蜆抗氧化肽具有較強(qiáng)的耐熱性，加熱到100℃仍能保持95%以上的活性；在酸性環(huán)境中活性保持較好，在堿性條件下喪失較快；蔗糖、NaCl對(duì)河蜆抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不明顯，而葡萄糖和山梨酸鉀會(huì)明顯降低河蜆抗氧化肽活性（p＜0.05）；K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽穩(wěn)定性均有不同程度的影響，其影響大小順序?yàn)椋篊u2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+。

河蜆，抗氧化肽，抗氧化穩(wěn)定性，羥自由基清除率

機(jī)體氧化產(chǎn)生的自由基與人體衰老、許多疾病有關(guān)［1-2］?？寡趸挠捎谄淞己玫目寡趸钚?、低毒、分子量低易吸收等特性而成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一［3］。

河蜆，學(xué)名（Corbicula flum inea），又稱黃蜆、金蚶、扁螺等，是雙殼類軟體動(dòng)物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一。廣泛分布于我國(guó)湖泊、江河中，天然資源豐富。河蜆含有豐富的蛋白質(zhì)（干樣中粗蛋白含量達(dá)66%以上）［4］、糖原、必需氨基酸、?；撬帷⒍喾N維生素，以及鈣、磷、鐵、硒等具有特殊生理作用的礦物質(zhì)，還含有活性肽等生理活性物質(zhì)。由于河蜆?biāo)哂械臓I(yíng)養(yǎng)、藥用及食療價(jià)值，對(duì)河蜆的開(kāi)發(fā)研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外專家和學(xué)者的關(guān)注。邱春江等［5］利用木瓜蛋白酶水解花蜆蛋白，得到的酶解物具有很強(qiáng)的清除羥自由基能力。劉杰等［6］研究了河蜆酶解液的體外抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)酶解液具有顯著的清除超氧陰離子自由基和羥自由基作用。張磊等［7］探討了河蜆提取物可能通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)酒精性肝損傷有保護(hù)作用。韓鵬等［8］研究了河蜆乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用。

近年來(lái)利用可控酶解技術(shù)從水產(chǎn)品中制備抗氧化活性肽的研究時(shí)有報(bào)道，如Je等［9］采用海魚(yú)副產(chǎn)物（如鱈魚(yú)骨架蛋白、青鱈魚(yú)皮膠原蛋白、阿拉斯加青鱈魚(yú)骨架蛋白等）制備出具有抗氧化活性的水解產(chǎn)物；Suetsuna［10］、Wu等［11］分別采用沙丁油魚(yú)、鯖魚(yú)水解得到了魚(yú)類抗氧化肽。

目前，河蜆資源主要以鮮銷為主，或者制成蜆干、咸蜆、罐頭等粗加工方面，河蜆的鮮銷和初級(jí)產(chǎn)品遠(yuǎn)沒(méi)有發(fā)揮其應(yīng)有的利用潛能，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展和人工飼養(yǎng)技術(shù)的不斷提高，河蜆產(chǎn)量的逐年增長(zhǎng)也為河蜆抗氧化肽的開(kāi)發(fā)與綜合利用提供了豐富的原料來(lái)源。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)酶處理技術(shù)對(duì)河蜆肉進(jìn)行酶解，得到了有較強(qiáng)抗氧化能力的肽混合物。本文進(jìn)一步研究溫度、pH、食品原料、防腐劑和不同金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽穩(wěn)定性的影響，旨在為河蜆抗氧化肽作為功能性抗氧化劑的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

速凍河蜆肉江蘇省宿遷楠景水產(chǎn)品有限公司；中性蛋白酶蛋白酶活力不小于60000U/g，KAYON公司生產(chǎn)；鄰二氮菲、無(wú)水乙醇、雙氧水、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、蔗糖、葡萄糖、NaCl、山梨酸鉀、氯化銅、硝酸鋅、硫酸鈣、氯化鎂、氯化鉀、抗壞血酸均為分析純。

UV-754紫外分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SQ2119B食品料理機(jī)上海帥佳電子科技有限公司；EL104電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；BCD-216TDXZ冰箱青島海爾股份有限公司；HHS-11-2水浴鍋江蘇金壇宏凱儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；ALPHA1-4冷凍干燥機(jī)德國(guó)MARTIN CHRIST公司；PHS-3C精密pH計(jì)上海雷磁精密儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1河蜆抗氧化肽制備根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，得工藝為：河蜆肉流水解凍→以料液比1∶2（g/mL）加水后用食品料理機(jī)勻漿→調(diào)節(jié)pH至6.0→添加0.94%中性蛋白酶（w/w），置于55℃恒溫水浴鍋中酶解4h→沸水浴中滅酶10min→冷卻至室溫→4000r/min離心20min→收集上清液→超濾膜（5000D）超濾→透過(guò)液→冷凍干燥→抗氧化肽粗品。

1.2.2羥自由基清除能力測(cè)定參照趙謀明等［12］的方法。取濃度為5mmol/L鄰二氮菲0.6m L于試管中，加入0.15mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.4）0.4m L，混合均勻后加入濃度為5mmol/L FeSO4溶液0.6m L，充分搖勻，加入樣品2m L（質(zhì)量濃度為10g/L）以及0.1%H2O20.4m L，混勻，37℃保溫1h后，測(cè)樣品管在波長(zhǎng)536nm處的吸光值A(chǔ)樣品。選用去離子水代替樣品液后重復(fù)上述工作，得損傷管吸光度值A(chǔ)損傷，采用去離子水代替樣品液和H2O2溶液，得到未損傷吸光度A未損傷。清除率計(jì)算公式如下：

1.2.3河蜆抗氧化肽活性保持率測(cè)定分別測(cè)定河蜆抗氧化肽處理前的羥基自由基清除率A1和處理后的羥基自由基清除率A2，則其活性保持率為：

1.2.4河蜆抗氧化肽穩(wěn)定性影響因素實(shí)驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)［12-14］的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.4.1溫度對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響取河蜆抗氧化肽（質(zhì)量濃度為10mg/m L）2m L于具塞試管中，分別在水浴鍋（50、70、90、100℃）熱處理1h，測(cè)定其活性保持率。

1.2.4.2pH對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響取河蜆抗氧化肽（質(zhì)量濃度為10mg/m L）2m L于具塞試管中，分別用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至2、3、4、5、6、7、8、9后，測(cè)定其活性保持率。

1.2.4.3食品原料對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響取河蜆抗氧化肽（質(zhì)量濃度為10mg/m L）2m L于具塞試管中，分別添加1m L不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖（2%、4%、6%、8%、10%）、葡萄糖（2%、4%、6%、8%、10%）、NaCl（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）溶液，測(cè)定其活性保持率。

1.2.4.4防腐劑對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響取河蜆抗氧化肽（質(zhì)量濃度為10mg/m L）2m L于具塞試管中，分別添加1m L不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.004%、0.008%、0.012%、0.016%、0.020%）山梨酸鉀溶液后，測(cè)定其活性保持率。

1.2.4.5金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響取河蜆抗氧化肽（質(zhì)量濃度為10mg/m L）2m L于具塞試管中，分別添加1m L濃度分別為5、10、50、100、500mg/L的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金屬離子溶液，測(cè)定其活性保持率。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)至少3次重復(fù)，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1溫度對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響結(jié)果見(jiàn)圖1，河蜆抗氧化肽溶液在溫度為50～90℃范圍內(nèi)加熱1h時(shí)，活性保持率為100%；加熱到100℃仍能保持95%以上的活性。這說(shuō)明在一定溫度范圍內(nèi)河蜆抗氧化肽對(duì)羥自由基清除率影響不明顯，可以耐受加工過(guò)程較高溫度的處理。

圖1　溫度對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.1　Effectof temperature on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

2.2pH對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

pH對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響結(jié)果見(jiàn)圖2，在pH＜7的條件下對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化活性影響很小，在極酸環(huán)境（pH=2）下仍能保持95%以上活性；但當(dāng)pH＞7時(shí)活性喪失很快；pH=9時(shí)，活性僅剩40.2%，說(shuō)明河蜆抗氧化肽不耐堿。河蜆抗氧化肽不耐堿可能是由于在堿性條件下發(fā)生了脫酰胺或者消旋反應(yīng)而使肽鏈的構(gòu)象發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致活性喪失［15］。

圖2　pH對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.2　Effectof pH on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

2.3食品原料對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

葡萄糖對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化活性的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著葡萄糖濃度增加，河蜆抗氧化肽的活性呈下降趨勢(shì)；當(dāng)葡萄糖濃度為2%、4%和6%時(shí)，對(duì)抗氧化肽活性的影響沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），且葡萄糖濃度為2%時(shí)，對(duì)抗氧化肽的活性影響很小，活性保持率為98.5%；葡萄糖濃度為10%時(shí)，活性保持率僅為60.1%。

圖3　葡萄糖對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.3　Effect of glucose on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

蔗糖對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化活性的影響見(jiàn)圖4。蔗糖濃度在2%～10%范圍內(nèi)，對(duì)河蜆抗氧化肽的活性影響沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），活性均保持在90%以上。

圖4　蔗糖對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.4　Effectof sucrose on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

由于食品加工過(guò)程經(jīng)常用到NaCl，NaCl對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化活性的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，不同濃度的NaCl對(duì)河蜆抗氧化肽的活性保持率均有影響，呈現(xiàn)下降的波動(dòng)趨勢(shì)。當(dāng)NaCl濃度為0.5%和1.0%時(shí)，對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化活性影響沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），活性均保持在90%以上；當(dāng)NaCl濃度為1.5%、2.0%和2.5%時(shí)，對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化活性影響沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），但活性保持率稍低，均在80%以上。由此可見(jiàn)，脫鹽處理能較好保證河蜆抗氧化肽的抗氧化性。

圖5　NaCl對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effectof NaCl on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

食品原料中，濃度為8%、10%的葡萄糖對(duì)河蜆抗氧化肽影響差異顯著（p＜0.05），不同濃度蔗糖和NaCl對(duì)河蜆抗氧化肽影響沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）。

2.4防腐劑對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

從圖6可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著山梨酸鉀濃度增加，河蜆抗氧化肽活性保持率呈下降的趨勢(shì)，且不同濃度的山梨酸鉀對(duì)河蜆抗氧化肽活性的影響有顯著性差異（p＜0.05）；當(dāng)山梨酸鉀濃度達(dá)到0.02%時(shí)，其活性保持率僅為33.8%，其原因有待進(jìn)一步研究。

圖6　山梨酸鉀對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.6　Effectof potassium sorbate on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

2.5金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

不同金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖7。隨著金屬離子濃度增加，河蜆抗氧化肽抗氧化活性均有不同程度的下降。說(shuō)明河蜆抗氧化肽對(duì)金屬離子較為敏感，其影響順序依次為：Cu2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+。其中Cu2+影響最為明顯，當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到100mg/L時(shí)，活性完全喪失，說(shuō)明河蜆抗氧化肽對(duì)Cu2+非常敏感。而不同濃度的K+和Mg2+對(duì)河蜆抗氧化肽活性影響較小，且不同濃度之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）。

圖7　金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.7　Effectofmetal irons on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

3　結(jié)論

3.1河蜆抗氧化肽具有很好的耐熱性，加熱到100℃仍能保持95%左右的抗氧化活性；酸性條件對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性影響不顯著，極酸環(huán)境（pH＝2.0）時(shí)仍能保持95%以上的活性。在堿性條件下活性損失較快，當(dāng)pH增加到9.0時(shí)，河蜆抗氧化肽抗氧化活性僅為40.2%。

3.2蔗糖、NaCl對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性影響不顯著，而葡萄糖、山梨酸鉀則會(huì)明顯降低河蜆抗氧化肽的抗氧化活性。

3.3常見(jiàn)的金屬離子對(duì)河蜆抗氧化肽抗氧化穩(wěn)定性影響不一，影響大小先后順序?yàn)镃u2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+。其中Cu2+影響最大，較高濃度下會(huì)使活性完全喪失；K+、Mg2+影響較小，在生產(chǎn)和加工河蜆抗氧化肽時(shí)應(yīng)盡量避免與含Cu2+材料接觸。

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Study on antioxidation stability of antioxidant peptide from Corbicula flum inea

LIU Jing-jing，WANG Ye，HAN Yao-ping，WANG Xue-feng，DAIYang-jun
（Departmentof Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China）

The change of scavenging ac tivity on hyd roxyl free rad ical of antioxidant pep tide from Corbicula flum inea was the index to study the effect of temperature，pH，food ingredients，p reservatives and different metal ions on antioxidation stability of the pep tide.The results showed that antioxidant pep tide from Corbicula flum inea had strong heat-resistance，heated to 100℃stillmaintained more than 95%active.Itmaintained high activity in acid ity environment，but losed its activity in alkaline environment.Surcrose and NaCl had little effects on its antioxidation stability，but g lucose and potassium sorbate lowered the oxidation stability of antioxidant pep tide from Corbicula flum inea（p＜0.05）.Metal ions such as K+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Cu2+affected the stability，and the orderwas Cu2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+.

Corbicula flum inea；antioxidant pep tide；antioxidation stability；hyd roxyl free rad ical scavenging

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0086-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.011

2014-08-04

劉晶晶（1978-），女，碩士，副教授，研究方向：食品加工和天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用。

江蘇省蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201303）。