何紅暉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

柴胡口服液HPLC指紋圖譜及柴胡皂苷b2的含量檢測(cè)分析

何紅暉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

目的 根據(jù)柴胡口服液HPLC指紋圖譜及柴胡皂苷b2的含量，提供評(píng)價(jià)質(zhì)量的方法。方法 根據(jù)HPLC方法對(duì)5批柴胡口服液進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，建立柴胡口服液標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并測(cè)定每批制劑柴胡皂苷b2的含量以及制劑的相似度。結(jié)果 5批柴胡口服液的HPLC指紋圖譜共有5個(gè)峰，相似度＞0.945，柴胡皂苷b2在0.0395～0.7935 μg顯示存在良好的線性關(guān)系。結(jié)論 柴胡口服液制劑與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比評(píng)價(jià)質(zhì)，操作方便，可有效用于評(píng)價(jià)柴胡口服液的質(zhì)量。

柴胡口服液；HPLC指紋圖譜；柴胡皂苷b2

柴胡口服液為一種單味制劑，主要是由柴胡揮發(fā)油和柴胡水煎液混合而形成，其具有解表退熱，癥見(jiàn)口干而渴、頭痛身楚、身熱面赤功效。為了保證用藥質(zhì)量，采用薄層色譜法評(píng)價(jià)柴胡口服液的質(zhì)量［1-2］。本次研究中，提出柴胡口服液HPLC指紋圖譜研究方法，并對(duì)柴胡皂苷b2含量進(jìn)行測(cè)定，其應(yīng)用更為方便高效，報(bào)道如下。

1　材 料

高效液相色譜儀，色譜工作站，電子天平，超純水器，數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)。柴胡口服液，柴胡皂苷b2對(duì)照品，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

2　方 法

2.1色譜條件：色譜柱為（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相水（A）-乙腈（B），洗脫程序0～20 min，30%～38%B，20～25 min，38%～40%B，25～35 min，40%～50%B；35～45 min，50%～60%B；45～45.5 min，60%～30%B。45.5～50 min，30%B；45.5～50 min，30%B。柱溫設(shè)置為25 ℃，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm，進(jìn)樣體積為10 μL。柴胡皂苷b2理論塔板數(shù)應(yīng)高于5000。

2.2制備供試品溶液：取2 mL柴胡口服液，之后通過(guò)SPE小柱，依次采用20 mL 50%甲醇和甲醇10 mL洗脫為對(duì)照組，甲醇洗脫部位作為供試品。洗脫液分別采用水浴濃縮到干燥，殘?jiān)捎眉状级ㄈ莸? mL，并經(jīng)過(guò)0.45微孔濾膜。

2.3陰性供試品溶液制備：根據(jù)處方的比例，稱取不包括柴胡敷料，并根據(jù)藥典工藝將其制備成陰性供試品溶液。

2.4制備對(duì)照品溶液：取柴胡皂苷b2作適量對(duì)照品，并按照精確的劑量稱取，之后將甲醇加入其中，制作出1 mL含量79.33 μg的溶液，并將其放置于10 ℃下環(huán)境中留作保存。

2.5對(duì)照組實(shí)驗(yàn)：取出劑量分別為10 μL對(duì)照品、樣品溶液、陰性、50%甲醇洗脫液以及50%甲醇洗脫液與適量的柴胡皂苷b2，將其注入到高效液相色譜儀中，根據(jù)2.1色譜條件取樣，詳細(xì)記錄到色譜圖中。

2.6考察線性關(guān)系：按照所需劑量稱取2.3項(xiàng)目下柴胡皂苷b2對(duì)照品溶液，并與甲醇進(jìn)行稀釋，分別得出6個(gè)不同質(zhì)量濃度，分別為79.32，51.93，39.87，15.97，7.68，3.91mg/L，并根據(jù)2.1色譜條件分別取樣10 μL，其中橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量（X），縱坐標(biāo)為峰面積（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出的線性回歸方程為Y=19282X-78487（r=0.992），研究結(jié)果表明，柴胡皂苷b2進(jìn)樣量為0.0387～0.7924 μg與峰面積顯示為良好的線性關(guān)系。

2.7精密度試驗(yàn)：取出同一供試品溶液，根據(jù)2.1的色譜條件連續(xù)取樣5次，詳細(xì)記錄色譜圖中共有峰面積，計(jì)算出5次RSD，各共有峰的RSD均＜3%，研究結(jié)果表明儀器的精密度顯示儀器良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)：分別制備出5份供試品溶液，并按照2.1的色譜條件取樣，記錄各共有峰峰面積，計(jì)算5分平行樣品間的RSD＜3%，與指紋圖譜要求相符，顯示有良好的重復(fù)性。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)：將供試品溶液制備出，并將其放置在室溫條件下，在相同條件下分別在0、4、8、12、24 h等各個(gè)時(shí)段進(jìn)行分析研究，考察供試品溶液當(dāng)天的穩(wěn)定性。觀察可見(jiàn)共有峰峰面積RSD＜3%，與指紋圖譜要求相符，表明樣品在24 h處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.10加樣回收率實(shí)驗(yàn)：取出已知含量的柴胡口服液1 mL樣品，并分別將其放置于濃度為1 mL的柴胡皂苷b2對(duì)照品溶液中，并根據(jù)2.2項(xiàng)下平行操作6份，根據(jù)2.1色譜條件取樣分析。計(jì)算出加樣回收率，并計(jì)算出RSD。

表1　柴胡口服液5批柴胡口服液樣品相對(duì)峰面積

3　結(jié) 果

3.1建立柴胡口服液的HPLC指紋圖譜：根據(jù)2.2項(xiàng)下制備的5批柴胡口服液樣品，以2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并詳細(xì)記錄各色譜圖，按照6號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算出各有峰相對(duì)峰面積，結(jié)果具體見(jiàn)表1。

3.2柴胡口服液含量測(cè)定：柴胡口服液根據(jù)2.2項(xiàng)下制備，測(cè)定柴胡皂苷b2含量，具體見(jiàn)表2。

表2　柴胡口服液中柴胡皂苷b2含量（mg/L）

4　討 論

4.1選擇樣品處理方法：根據(jù)色譜圖形比較不同的樣品處理方法，并根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)方法，采用SPE小柱實(shí)施樣品前處理，分別采用10 mL水+30%甲醇20 mL，10 mL甲醇+10 mL 50%甲醇，20 mL 50%甲醇，分別對(duì)柴胡口服液實(shí)施雜質(zhì)洗脫，可見(jiàn)20 mL 50%甲醇洗脫后得出的色譜圖效果更良好［3］。

4.2考察除雜容積：同樣品的處理方法，取出50%甲醇20 mL洗脫液，水浴蒸干，50%甲醇定容為2 mL，并經(jīng)過(guò)0.45微孔進(jìn)行濾膜，平行1份將適量的柴胡皂苷b2作為對(duì)照品，并按照2.1色譜條件進(jìn)樣分析，應(yīng)保證無(wú)柴胡皂苷b2的任何流失［4］。

4.3選擇色譜條件：首先應(yīng)考慮流動(dòng)相水-乙腈不同梯度的洗脫情況，經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示可見(jiàn)所用條件的所得峰形好、分離效果良好，且基線比較平穩(wěn)，有利于分析指紋圖譜以及柴胡皂苷b2定量。

4.4選擇檢測(cè)波長(zhǎng)：本次研究中采用的檢測(cè)器為二極管陣列紫外檢測(cè)器，首先在2.1色譜條件下才也難怪全波長(zhǎng)進(jìn)行掃描測(cè)定檢查，并在199～400 nm下采集三維色譜圖，并綜合考慮三維色譜圖所在波長(zhǎng)下的出峰情況、基線平穩(wěn)程度以及各成分的具體分離情況，考慮可采用252 nm的波長(zhǎng)。指紋圖譜可將6號(hào)峰作為內(nèi)參照峰，因其保留時(shí)間居中大約為23.52 min，且分離效果良好［5］。

［1］劉偉，楊艷玲，劉乃強(qiáng).柴胡口服液HPLC指紋圖譜及柴胡皂苷b2的含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（8）：134-135.

［2］李艷榮，崔鳳俠，杜義龍.柴胡的HPLC指紋圖譜研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2013，28（1）：86-88.

［3］李軍，姜華，石任兵.HPLC法測(cè)定柴胡口服液中柴胡皂苷b2的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（5）：743-745.

［4］趙麗，鐘巧妮，雷玉霞.柴胡總苷高效液相色譜指紋圖譜與主成分含量測(cè)定［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27（3）：323.

［5］李棣華，劉俊紅，伍孝先.山西產(chǎn)柴胡中皂苷類成分HPLC指紋圖譜初步研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（5）：89-90.

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1671-8194（2015）012-0044-02