陳翠萍等

摘要：多室油菜具有多室多粒的特征，是提高油菜產(chǎn)量的一個有效途徑。利用青海芥菜型多室油菜的BC4分離群體對油菜多室基因Bjln2進行初步定位，對分離群體的性狀分離比進行卡方檢測，檢測結(jié)果符合1 ∶1，表明多室性狀遺傳穩(wěn)定。利用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）與分群分析法（bulk segregate analysis，BSA） 相結(jié)合的方法共篩選獲得3個與目標基因緊密連鎖的標記。連鎖遺傳分析的結(jié)果表明，3個AFLP標記均位于基因Bjln2的同側(cè)，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遺傳距離約為13.1 cM；SA14MC13距Bjln2基因最遠，遺傳距離約為23.5 cM；圖譜總長23.5 cM，標記間平均圖距為7.8 cM。研究結(jié)果為多室基因的精細定位及圖位克隆奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青海??；芥菜型油菜；多室；基因定位；擴增片段長度多態(tài)性；分群分析法

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0032-03

收稿日期：2015-03-19

基金項目：國家“863”計劃（編號：2011AA10A104）；青海省重點實驗室發(fā)展專項（編號：2014-Z-Y11）。

作者簡介：陳翠萍（1989—），女，陜西渭南人，碩士研究生，研究方向為春油菜分子生物學(xué)。E-mail：chencuiyang@126.com。油菜是世界4大油料作物之一，在世界油料作物中占有重要地位。一般來說，油菜的成熟角果內(nèi)有膜狀隔膜（或稱假隔膜），將每個角果分為2室，外被2片殼狀果瓣；多室油菜的角果被假隔膜分為3～4室，外被3～4片殼狀果瓣。油菜的多室性狀在目前種植的3大類型油菜中均有發(fā)現(xiàn)：在芥菜型油菜中，有山西省的三筒油菜、貴州省的四輪油菜、青海省的多室油菜、四川省的四棱油菜；白菜型油菜中有印度沙遜油菜、西藏的桑日白油菜等；甘藍型油菜中有三棱角油菜、人工創(chuàng)造的甘藍型多室油菜[1-3]。趙洪朝等發(fā)現(xiàn)，多室油菜的單株產(chǎn)量顯著高于相同遺傳背景下2室油菜的單株產(chǎn)量，主要原因是多室油菜角粒數(shù)多[4-6]。

呂澤文等對芥菜型多室和2室角果、子房石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，多室角果由4心皮發(fā)育而來，4個果瓣包圍種子，2個假隔膜平行，將角果分隔成3個腔室，中間的腔室大于兩側(cè)的腔室[5]。有學(xué)者對白菜型多室油菜的雌蕊子房橫切切片觀察發(fā)現(xiàn)，多室油菜的子房有12～16個心皮維管束，子房在發(fā)育過程中心皮連成1個圓環(huán)，之后房室開始分化，胚珠、假隔膜同時發(fā)生。朱彥濤對甘藍型多室研究發(fā)現(xiàn)，多室角果橫切面呈3室，隔膜橫截面呈“Y”形[7]。

Varshney對印度沙遜油菜進行研究發(fā)現(xiàn)，角果果室性狀受1對基因控制，且2室對多室表現(xiàn)完全顯性[8]。何余堂等研究表明，白菜型油菜的多室性狀受1對隱性基因控制[9]。Choudhary對印度芥菜型多室油菜研究發(fā)現(xiàn)，2室為顯性性狀，4室為隱性性狀，多室性狀受2對隱性基因控制[10-11]。趙洪朝等對芥菜型多室性狀的遺傳規(guī)律進行研究發(fā)現(xiàn)，多室性狀的遺傳受1對主效基因控制，且被微效基因所修飾，無胞質(zhì)效應(yīng)[12]。呂澤文利用甘肅芥菜型多室油菜為材料，證實多室性狀受2對獨立遺傳的隱性核基因控制，且多室性狀無細胞質(zhì)效應(yīng)，遺傳穩(wěn)定，將這2對多室基因分別命名為mc1、mc2[13]。初步定位的結(jié)果表明，mc1基因位于A基因組上。Xiao等對青海芥菜型多室油菜遺傳分析表明，多室性狀受2個獨立遺傳的基因控制，且多室為隱性性狀，無胞質(zhì)效應(yīng)，分別定義為Bjln1、Bjln2[14]。

獲得與多室性狀緊密連鎖的分子標記為多室性狀基因定位及克隆奠定基礎(chǔ)，同時也有利于利用分子標記對多室性狀進行快速而準確的跟蹤，從而加速多室油菜的選育進程[15-16]。Xu等利用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）分子標記對Mc1進行精細定位，篩選到目標基因Mc1兩側(cè)最近的連鎖標記EC14MC14、SC20，分別距離Mc1 1.1、1.6cM，將Mc1定位于A基因組第7染色體上，構(gòu)建了Mc1的連鎖圖譜[17]。Xiao等通過AFLP和SSR分子標記，篩選到與Bjln1緊密連鎖的2個AFLP標記和7個SSR標記，將多室基因Bjln1進行基因定位，將控制多室的Bjln1基因定位到A7連鎖群的約208 kb左右的區(qū)域內(nèi)[14]。

Fan等利用多室突變體m14和二室野生型白菜型油菜為材料，通過對CLV3類似物的分離和功能特性的研究認為，單核苷酸替代（T-C）后的新型BrCLV3是控制頂端分生組織大小、腔室和角果粒數(shù)多少的主要原因[18]。表達分析表明，反饋回路中涉及到CLV3、WUS的假定的負調(diào)控途徑在m14突變體中被中斷。

番茄中也有多室性狀的研究。Muos等對番茄多室性狀研究時發(fā)現(xiàn)，番茄的多室性狀主要受2對QTL控制，分別為fas、lc 2對基因相互影響[19]。lc QTL包括1 600 bp堿基，距WUSCHEL 3′末端1 080 bp堿基，通過編碼蛋白質(zhì)調(diào)控莖細胞。lc的分子進化顯示，2個單核苷酸多態(tài)性的異常導(dǎo)致遺傳多樣性降低，2個單堿基的突變導(dǎo)致了果室數(shù)目的增加。并認為果室數(shù)目的進化模型是fas突變出現(xiàn)在lc突變之后從而導(dǎo)致極端多室的形成，使番茄產(chǎn)量提高數(shù)倍。

本研究所用材料為青海芥菜型多室油菜，除具有多室性狀外，還具有黃籽、抗裂角等優(yōu)良性狀，是一種優(yōu)異的種質(zhì)資源[4，20]。遺傳分析結(jié)果表明，青海芥菜型油菜多室性狀受2個獨立遺傳的基因位點控制，即Bjln1、Bjln2，多室對2室為隱性，無胞質(zhì)效應(yīng)[14]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，以青海芥菜型油菜多室回交分離群體BC4為材料，利用AFLP標記[21]結(jié)合分群分析法（bulk segregate analysis，BSA）[22]，初步尋找與芥菜型油菜多室基因Bjln2緊密連鎖的分子標記，建立芥菜型油菜角果多室基因Bjln2位點所在區(qū)域的遺傳連鎖圖譜，為該基因的精細定位和克隆奠定基礎(chǔ)。同時，緊密連鎖的分子標記可將果室性狀的鑒定提早到苗期進行，從而加快育種進程，提高育種效率[23]。

1材料與方法

1.1材料與群體構(gòu)建

本試驗所用親本為青海芥菜型多室油菜和新芥（2室），青海芥菜型多室油菜是源于青藏高原的一種地方品種，有3～4個心皮。材料均由青海省農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所提供，經(jīng)過自交7代以上，多室性狀可以穩(wěn)定遺傳。青海芥菜型多室油菜與新芥雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代，F(xiàn)2代與親本多室油菜連續(xù)回交4代，得到包含1 754株的BC4分離群體，并隨機挑選198株單株作為試驗用的作圖分離群體。

1.2DNA 的提取及樣品池的構(gòu)建

在油菜苗期，對田間單株進行編號。植株長至4～5張真葉時，每個單株取2～3 cm2的新鮮葉片，用CTAB小樣法提取葉片總 DNA，具體方法參考Doyle等的方法[24]并略作改動。DNA濃度及質(zhì)量用紫外分光光度計檢測（Eppendorf Spectrophotometer，Biophotometer），再用TE緩沖液稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在油菜角果成熟期，對田間單株進行性狀調(diào)查。油菜2室與多室性狀鑒定采用肉眼鑒定的方法。單株多室角果率>95%記為多室株，沒有多室角果的單株記為2室株。根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，在BC4群體中隨機選擇12個多室單株和12個2室單株，每6個單株的DNA等量混合，分別構(gòu)建2個多室基因池和2個2室基因池，用于BSA分析。

1.3AFLP分析

AFLP分析參考陸光遠提到的Vos等的方法[25]并略作改動。采用的酶切組合為SacⅠ/MseⅠ，預(yù)擴增采用的引物組合為 SA/MC，預(yù)擴產(chǎn)物稀釋30倍后作為選擇性擴增的模板。將等體積的選擇性擴增產(chǎn)物和Loading Buffer （98%甲酰胺，0.025%二甲苯藍，0.025%溴酚藍，10 mmol/L EDTA，pH值8.0）混合，然后用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，硝酸銀染色觀察結(jié)果。

利用已構(gòu)建好的多室基因池、2室基因池進行引物篩選。有特異性的引物再在BC4群體中隨機挑選6株2室株、6株多室株進行驗證。

1.4連鎖分析

利用得到的AFLP標記對BC4分離群體中隨機挑選的198株單株進行檢測，結(jié)合田間性狀調(diào)查結(jié)果，篩選交換單株，計算重組率。利用JoinMap 4.0 軟件構(gòu)建遺傳圖譜，先用New project創(chuàng)建1個新的文件夾，用Load data 導(dǎo)入標記數(shù)據(jù)，再用Kosambi函數(shù)[26]將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳距離，最后用Map Draw 構(gòu)建連鎖圖譜。

2結(jié)果與分析

2.1BC4分離群體果室性狀表現(xiàn)

青海芥菜型多室油菜和新芥（2室）連續(xù)回交4代獲得的BC4分離群體有效單株共1 754株，其中多室單株882株，2室單株872株。經(jīng)卡方檢測，結(jié)果符合1 ∶1（χ2=0.057）（表1）。

2.2與Bjln2基因連鎖的AFLP標記

利用已構(gòu)建的多室基因池、2室基因池進行AFLP標記的篩選，將篩選得到的標記在BC4分離群體的單株中進行驗證，最終確定3個AFLP標記與Bjln2基因緊密連鎖。3個AFLP標記用于掃描BC4群體中的198個單株 （圖1）。

2.3遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

將BC4群體中198個單株的性狀和3個與Bjln2基因緊密連鎖的AFLP性標記數(shù)據(jù)導(dǎo)入JoinMap 4. 0軟件，分析3個標記與Bjln2基因的相對位置及距離。結(jié)果表明，這3個標記均位于Bjln2的同側(cè)，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遺傳距離約為13.1 cM；SA14MC13距Bjln2基因最遠，遺傳距離約為23.5 cM；圖譜總長23.5 cM，標記間平均圖距為7.8 cM（圖2）。

3結(jié)論與討論

目前，多室性狀在油菜3大栽培種（甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜）中均有發(fā)現(xiàn)。多項研究表明，多室油菜的單株產(chǎn)量顯著高于其對應(yīng)的二室油菜的單株產(chǎn)量，主要原因是多室油菜角粒數(shù)較多，因此油菜多室性狀對油菜產(chǎn)量的提高具有重要意義[4-6]。前人對青海芥菜型多室油菜的遺傳規(guī)律和基因定位進行了探究，證實其多室性狀是受2對獨立遺傳的基因控制，無胞質(zhì)效應(yīng)，并分別命名2對基因為Bjln1、Bjln2。同時進一步對Bjln1進行基因定位，將Bjln1基因定位到A7連鎖群的約208 kb左右的區(qū)域內(nèi)[14]。

本研究對因Bjln2基因進行初步定位。對BC4分離群體性狀分離卡方檢測后符合1 ∶1，證明多室性狀遺傳規(guī)律的穩(wěn)定性，為多室基因Bjln2的定位奠定基礎(chǔ)。利用256對AFLP引物進行引物篩選，共獲得3個與目標基因連鎖的AFLP標記，均位于Bjln2基因的同側(cè)，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遺傳距離約為13.1cM；SA14MC13距Bjln2基因最遠，遺傳距離約為23.5cM；圖譜總長23.5 cM，標記間平均間距為7.8 cM。Xu等將Mc1定位到A基因組7號染色體上，兩側(cè)最近的標記距離分別為1.1、1.6cM，構(gòu)建了Mc1的連鎖圖譜[17]。黃籽沙遜既有2室又有3室材料，Yadava等利用F2、F6、F7群體進行QTL定位，發(fā)現(xiàn)控制多室位點的基因位于A4連鎖群，同時利用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）將其定位到Bra034340，與擬南芥中的CLAVATA3同源，并將此作為候選基因[27]。這與Fan等的研究結(jié)果[18]類似。由于本研究還未將Bjln2基因定位到染色體上，因此Bjln2基因是否與Fan等或Xu等報道的是同一個位點還不可知。

本研究所得的4個AFLP標記均位于Bjln2一側(cè)，且分布較為分散，這可能與所選的酶切組合有關(guān)，且本研究所選酶切組合較少，缺少有關(guān)EcoRⅠ/MseⅠ、PstⅠ/MseⅠ的酶切組合，所以沒能篩選到足夠多的AFLP標記，因此要盡量篩選出更多的與Bjln2緊密連鎖的分子標記。隨著與Bjln2連鎖的分子標記的增加，遺傳圖譜的精度會不斷提高，有利于多室基因的圖位克隆。甘藍型油菜是目前種植面積最大的栽培種，克隆獲得的多室基因可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入甘藍型油菜，從而加快甘藍型油菜的育種進程，提高油菜產(chǎn)量[28-37]。

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