高南等

摘要：Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉運及其他生理過程中發(fā)揮著重要作用。AKT2/3是Shaker類型K+通道中唯一既主導K+內流，又允許去極化情況下K+滲漏性外流的通道。水稻OsAKT2/3蛋白的生物信息學分析表明，OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標志性序列TxxTxGYGD；該基因分子式為C4219H6693N1179O1233S35，理論等電點為664，氨基酸殘基組成中亮氨酸殘基含量最高；有一定的親水性，為跨膜蛋白；可能存在31個翻譯后修飾位點、5種結構域、52個磷酸化位點，不含信號肽；序列主要構件為α-螺旋和折疊延伸；該蛋白與其他植物的AKT2/3家族成員具有較高的同源性。試驗結果為OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依據。

關鍵詞：水稻；二級結構；磷酸化位點；三級結構；系統(tǒng)進化

中圖分類號：Q785；Q945.12 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0025-03

鉀是植物必需的大量元素，對提高作物產量、改善產品品質起著重要作用。水稻（Oryza sativa L.）對鉀素的需求量較大，不同基因型的水稻對土壤中鉀素的吸收利用存在很大差異[1]。缺鉀可影響細胞滲透壓平衡，進而引起器官機能的破壞，影響植物的正常生長；并通過植物激素調節(jié)破壞植物體內的代謝和轉運過程，導致作物的產量和品質大幅下降[2]。我國大部分耕地土壤供鉀不足，其中嚴重缺鉀土壤（速效鉀<50 mg/kg）約2 000萬hm2，占耕地面積的20%以上，且主要分布于我國的水稻產區(qū)；因此，需施用鉀素化肥以保證水稻的豐產和品質，而我國鉀礦資源十分匱乏，95%以上的鉀肥供應依賴進口[3]。K+通道在植物體內的表達能改良植物的鉀素營養(yǎng)性狀[4-5]；因此，挖掘植物中鉀吸收利用的基因并研究其生理功能，對水稻鉀營養(yǎng)性狀的改良及現(xiàn)有鉀素資源的利用具有重要意義。Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉運及其他生理過程中發(fā)揮著重要作用[2，6-7]。AKT2/3是Shaker類型K+通道中唯一既主導K+內流、又允許去極化情況下K+滲漏性外流的通道，其電生理特征表現(xiàn)為弱內向整流、能夠感應K+水平、受Ca2+和H+調控[8-9]。其獨有的滲漏型電流，在過量K+迅速吸收進入細胞而導致的膜電位去極化情況下，通過胞內K+的滲漏從而實現(xiàn)對膜電位的精確微調作用[10]。目前，水稻的基因組測序已經完成，但關于水稻K+通道的研究尚較少[11-13]。本研究利用生物信息學的方法對水稻OsAKT2/3蛋白的理化性質、核苷酸序列組成、跨膜結構、親水性、疏水性、亞細胞定位進行分析，并對其結構域、磷酸化位點、二級結構、三級結構進行預測，最后進行系統(tǒng)進化分析，以全面了解OsAKT2/3基因，為該基因生理功能的深入研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料

NCBI中GenBank數(shù)據庫已注冊水稻OsAKT2/3基因（JN989970.1）、擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]的AKT2/3（NP_567651.1）、大麥（Hordeum vulgare L.）的HvAKT2（ABE99811.1）、雨樹[Samanea saman （Jacq.）Merr.]的SPICK1（AAD16278.1）和SPICK2（AAD39492.1）、歐美楊（Populus tremula L.×Populus tremuloides Michx.）的PTK2（CAC05489.1）、玉米（Zea mays L.）的ZMK2（NP_001105120.1）。1.2方法

OsAKT2/3蛋白的理化性質使用ProtParam軟件在線分析；蛋白跨膜結構使用TMHMM軟件在線分析；親水性及疏水性使用ProtScale軟件在線分析；蛋白亞細胞定位使用TargetP軟件、WoLF PSORT軟件在線分析；蛋白序列上潛在的結構域和功能位點使用MotifScan軟件、CCD軟件預測；蛋白磷酸化位點使用NetPhos軟件在線分析；蛋白信號序列使用SignalP4.1軟件在線分析；蛋白二級結構使用SOPMA軟件在線分析；蛋白三級結構使用Phyre2軟件在線分析；利用MEGA 6.05軟件，采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹。上述各分析軟件的網址見表1。

2結果與分析

2.1OsAKT2/3蛋白的理化性質分析

由序列分析結果可知，OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標志性序列TxxTxGYGD。用ProtParam軟件分析得知，OsAKT2/3 蛋白共有13 359個原子，分子量為94 783.8，蛋白的分子式為C4219H6693N1179O1233S35，理論等電點為6.64。在855個氨基酸殘基組成中，OsAKT2/3蛋白的N端為蛋氨酸，含量較高的氨基酸殘基包括亮氨酸殘基（10.2%）、纈氨酸殘基（8.5%）、甘氨酸殘基（7.3%）、精氨酸殘基（7.1%）、絲氨酸殘基（7.1%）；含量較低的氨基酸殘基包括色氨酸殘基（1.1%）、半胱氨酸殘基（1.4%）等。帶負電荷的氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）殘基為99個；帶正電荷的氨基酸（精氨酸、賴氨酸）殘基為95個。OsAKT2/3蛋白在哺乳動物、酵母、大腸桿菌中的半衰期分別為30 h（體外）、>20 h（體內）、>10 h（體內），不穩(wěn)定指數(shù)為39.03，該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

2.2OsAKT2/3蛋白的親水性、疏水性、亞細胞定位

使用ProtScale軟件預測OsAKT2/3蛋白的親水性及疏水性可知，氨基酸的最低分值為-2.967，最高分值為3.133（圖1）。整體來看，親水性氨基酸殘基分布于整條肽鏈，且多于疏水性氨基酸殘基。使用TMHMM軟件進行預測，將參數(shù)設置為默認值，可知OsAKT2/3蛋白為跨膜蛋白。WolfPsort軟件預測該蛋白可能在細胞質膜上，TargetP軟件預測該蛋白在葉綠體膜上的可能性為79.6%。

2.3OsAKT2/3蛋白結構域、功能位點的預測

OsAKT2/3蛋白序列上潛在的結構域、功能位點使用MotifScan軟件、CCD軟件進行預測。結果表明，該蛋白可能存在的翻譯后修飾位點包括1個酰胺化位點、4個N-糖基化位點、1個cAMP磷酸化位點、11個酪蛋白激酶Ⅱ位點、7個?；稽c、7個蛋白激酶磷酸化位點；發(fā)現(xiàn)5種結構域，分別為錨蛋白重復（ANK，cd00204）、環(huán)核苷酸結合結構域（CAP_ED，cd00038）、未知功能的DUF3354超級家族結構域（DUF3354，pfam11834）、離子轉運結構域（Ion_trans_2，pfam07885）、電壓依賴的鉀離子通道結構域（PLN03192，PLN03192）（圖2）。該蛋白具有Shaker基因家族的典型特征，即蛋白的N末端包括6個跨膜區(qū)（S1～S6），有電壓感受區(qū)和高度保守的通道孔區(qū)。使用磷酸化位點預測程序NetPhos 2.0發(fā)現(xiàn)OsAKT2/3蛋白有37個潛在的絲氨酸磷酸化位點、7個潛在的蘇氨酸磷酸化位點、8個潛在的酪氨酸磷酸化位點。使用SignalP 4.1 Server軟件在線分析OsAKT2/3蛋白的信號肽情況，結果顯示該蛋白不含信號肽序列。

2.4OsAKT2/3蛋白二級結構、三級結構的分析

使用SOPMA軟件預測OsAKT2/3蛋白的二級結構，結果顯示OsAKT2/3蛋白由43.16%的α-螺旋、17.19%的折疊延伸、8.30%的β-轉角、31.35%的無規(guī)則卷曲構成，其中折疊延伸和β-轉角不均勻分布于整個蛋白質的多肽鏈上。依據模板c2ptmA，采用折疊識別法，使用Phyer2軟件在線預測OsAKT2/3蛋白序列主鏈原子位置，生成預測蛋白三級結構模型（圖3），并依據能量最小化原理使側鏈集團處于能量最小的位置。該蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，與蛋白質二級結構分析結果相似。

2.5OsAKT2/3編碼基因的系統(tǒng)進化分析

在NCBI上共選取6種植物的7個AKT2/3基因序列，以擬南芥KAT1基因作為外群，構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，水稻OsAKT2/3在進化上與單子葉植物玉米的ZMK2、單子葉植物大麥的HvAKT2的親緣關系較近，與雙子葉植物擬南芥的AKT2/3等有較高的相似度（圖4）。

3結論與討論

蛋白質的功能不僅取決于其一級結構，在很大程度上也取決于其高級結構。生物信息學綜合運用數(shù)學、計算機技術、生物學的各種工具，較好地闡明和理解大量數(shù)據所包含的生物學意義。基因序列及其特性分析、蛋白質空間結構模擬等是生物信息學的重要組成部分。利用生物信息學的原理，通過計算機模擬相關的輔助信息，可在較短時間內，用較低成本獲得大量可靠的蛋白質結構和功能信息[14-15]。本研究通過網絡資源，在前期獲得水稻OsAKT2/3的基礎上，應 用ProtParam、TMHMM等分析軟件，對OsAKT2/3蛋白的亞細胞定位、結構域、磷酸化位點、二級結構等蛋白特性進行預測，并對其三級結構進行初步分析模擬，以期盡可能多地獲得該蛋白質結構及功能的信息，為OsAKT2/3基因功能的研究提供更多、更可靠的理論依據。

Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉運及其他生理過程中發(fā)揮著重要作用[2，6，11]。OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標志性序列TxxTxGYGD；該基因分子式為C4219H6693N1179O1233S35，理論等電點為6.64，氨基酸殘基組成中亮氨酸殘基含量最高；有一定的親水性，為跨膜蛋白；可能存在31個翻譯后修飾位點、5種結構域、52個磷酸化位點，不含信號肽；序列主要構件為α-螺旋和折疊延伸；該蛋白與其他植物的AKT2/3家族成員具有較高的同源性。本試驗結果為OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依據。然而，同源性僅是基因序列和蛋白結構上的類似，雖然某些典型功能相近，但來源不同的同源通道常表現(xiàn)出獨特之處。在氨基酸序列、關鍵結構元件上，玉米的ZmK2.1 K+通道與擬南芥的KAT1通道均高度同源，但其功能特征卻存在顯著差異[16]。與其他AKT2/3型K+通道相比，OsAKT2/3的功能特征是否存在獨特之處仍需進一步研究。

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