王學(xué)君+盧春洪+王源+譚艾娟+呂世明+蔣慶慶+符東順

摘 要：為考察豬源沙門氏菌攜帶的I類整合子向人源細(xì)菌在體外接合試驗中的轉(zhuǎn)移頻率，在體外接合試驗中應(yīng)用PCR方法檢測細(xì)菌間I類整合子的轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明：人源沙門氏菌I類整合子轉(zhuǎn)移效率在1.6×10-3 ～2.5×10-4 cfu·mL-1（供體菌）之間，人源大腸桿菌I類整合子轉(zhuǎn)移效率在1.5×10-5 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （供體菌）之間，豬源沙門氏菌I類整合子未轉(zhuǎn)移給人源金黃色葡萄球菌。因此，豬源沙門氏菌I類整合子攜帶耐藥基因盒在體外可向人源革蘭氏陰性菌發(fā)生轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移頻率較高。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；體外接合試驗； 整合子；轉(zhuǎn)移

中圖分類號：R446.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.10.004

Abstract： To investigate the transfer frequency of class I integrons from swine Salmonella to human bacteria on the conjugation test in vitro， the transfertation of class I integrons between the strains was determined with PCR method. Results showed that the transfertation rate of class I integrons from swine Salmonella to human Escherichia coli were in 1.6×10-3 ～2.5×10-4 cfu·mL-1 （donor strain）， and to human Salmonella were 1.5×10-5 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （donor strain）. Class I integrons were no found in human in human Staphylococcus aureus. So， class I integrons of swine Salmonellae could transfer to gram-negative bacteria of human origin in vitro and the transfer frequency was quite high.

Key words：Salmonella； integron； transfer； conjugation test in vitro

沙門氏菌（Salmonella）是全球公認(rèn)的主要動物源細(xì)菌傳染病，危害人和動物健康的重要致病菌，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)和食品安全[1]。整合子是介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要機制之一[2]，同時整合子可定位于質(zhì)粒上，也可以作為轉(zhuǎn)座子的一部分參與轉(zhuǎn)移，使耐藥基因在細(xì)菌種間和種內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。整合子攜帶耐藥基因體外轉(zhuǎn)移多集中在臨床菌株的研究中[4]，但對動物源細(xì)菌的報道較少，且整合子攜帶耐藥基因盒在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移，加快了臨床耐致病菌獲得耐藥性。本研究是將5株豬源沙門氏菌I類整合子陽性菌株與人源性不攜帶I類整合子的沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各1株進行耐藥基因的體外轉(zhuǎn)移試驗，考察I類整合子攜帶耐藥基因能否在人源、動物源細(xì)菌間傳播，為細(xì)菌耐藥性的傳播監(jiān)測提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 供體菌：豬源沙門氏菌5株，含有I類整合子（貴州大學(xué)藥理實驗室保存）。

受體菌：人源大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌各1株（由貴陽市疾病預(yù)防控制中心惠贈），且不攜帶I類整合子及耐藥基因盒。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 LB肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鈉瓊脂培養(yǎng)基（XLD）、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、貝爾德-帕克氏瓊脂培養(yǎng)基（BP）均購自杭州博微生物技術(shù)有限公司；四環(huán)素和鏈霉素購自上海博微科技有限公司。Ex Taq酶試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 體外接合試驗 [5-7] 供、受體菌分別于LB肉湯中37 ℃過夜；調(diào)整菌液為2個麥?zhǔn)蠞舛龋魑?.1 mL加入0.8 mL LB肉湯，37 ℃孵育4 h；菌液3 800 r·min-1離心2 min，棄上清液，1 mL生理鹽水將沉淀混勻；吸取0.1 mL涂布于MHA平板，37 ℃過夜；經(jīng)102～103倍稀釋后吸取0.1 mL菌液涂布于含雙抗菌藥物（0.02 mg·mL-1四環(huán)素+0.05 mg·mL-1鏈霉素）的EMB、XLD、BP選擇性培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；供體菌涂布于含單抗的XLD培養(yǎng)基上，受體菌涂布于單抗的EMB、XLD、BP平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 接合頻率統(tǒng)計 供/受體菌進行選擇性平板計數(shù)，當(dāng)供體菌和受體菌在雙抗選擇性培養(yǎng)基中不生長的情況下，計數(shù)接合菌、供受體菌數(shù)。接合頻率Fc （conjugation frequency）：Fc=T/R，T為耐藥性轉(zhuǎn)移接合子的平均菌落數(shù)，R為受體菌平均菌落數(shù)。

1.2.3 接合子中整合子陽性菌株檢測 在不同抗性平板上隨機挑選 10 個單菌落，進行 PCR 驗證，陽性菌株數(shù)為 I1，參照文獻(xiàn)[8]，以整合酶intI-F/intI-R為引物進行PCR擴增。上游：5′-CGATGCGTGGAGACCGAAACCTT-3′，下游：5′-GTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGC-3′，PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性300 s，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 S，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。產(chǎn)物采用2.0% 瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.4 體外I類整合子轉(zhuǎn)移效率的測定 由整合子轉(zhuǎn)移效率公式計算，整合子轉(zhuǎn)移率 =I1/N*Fc，其中，I1/N為 PCR 陽性率，M/D為接合效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外接合子篩選結(jié)果

從表1數(shù)據(jù)可知，5株豬源沙門氏菌與人源沙門氏菌的接合頻率在2.1×10-3～3.5×10-4之間；與人源大腸桿菌接合頻率在2.9×10-4～4.1×10-5之間；人源金黃色葡萄球菌接合頻率在2.3×10-7～5×10-8之間，且有兩株未檢測到接合子。

2.2 接合子中I類整合子陽性菌株檢測結(jié)果

部分接合子中I類整合子intI1基因PCR擴增結(jié)果見圖1。

由表2可知，5株人源沙門氏菌接合子中均檢測到I類整合子陽性菌株，4株人源大腸桿菌接合子中檢測得到I類整合子陽性菌株，人源金黃色葡萄球菌未檢測到I類整合子。人源沙門氏菌接合子中檢測得到陽性整合菌株明顯高于人源其他菌株，人源金黃色葡萄球菌接合子中未檢測到陽性整合菌株。

2.3 體外I類整合子轉(zhuǎn)移頻率結(jié)果

由表3可知，人源沙門氏菌I類整合子轉(zhuǎn)移頻率在1.6×10-3 ～2.5×10-4 cfu·mL-1 （供體菌）之間，人源大腸桿菌I類整合子轉(zhuǎn)移頻率在1.5×10-5 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （供體菌）之間，豬源沙門氏菌I類整合子未轉(zhuǎn)移給人源金黃色葡萄球菌。說明沙門氏菌同種屬之間轉(zhuǎn)移效率高于其他人源細(xì)菌，革蘭氏陰性菌之間整合子攜帶耐藥基因盒存在轉(zhuǎn)移風(fēng)險，革蘭氏陰性菌向陽性菌之間水平轉(zhuǎn)移可能性極小。

3 結(jié)論與討論

研究動物源性細(xì)菌整合子-基因盒系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥機制是控制細(xì)菌耐藥性傳播的根源途徑。本研究探討豬源沙門氏菌向人源不同菌種之間的水平轉(zhuǎn)移，從分子水平分析細(xì)菌耐藥性獲得及傳播方式，為我國動物源性細(xì)菌耐藥性傳遞研究積累基礎(chǔ)資料，為指導(dǎo)規(guī)模豬場合理選擇用藥、制定干預(yù)細(xì)菌多重耐藥的產(chǎn)生及傳播措施提供了理論依據(jù)。

通過體外轉(zhuǎn)移試驗，發(fā)現(xiàn)豬源沙門氏菌與人源細(xì)菌體外接合頻率在10-3～10-8之間，低于劉渠等[6]報道的接合頻率10-1～10-5，而本試驗中沙門氏菌同菌屬細(xì)菌之間的體外接合頻率高于不同菌屬細(xì)菌之間的接合頻率。

由豬源沙門氏菌I類整合子轉(zhuǎn)移頻率結(jié)果表明，整合子在人源沙門氏菌與人源大腸桿菌中存在轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移頻率1.6×10-3 ～8.3×10-6 cfu·mL-1 （供體菌）之間， 與文獻(xiàn)報道一致[9]。但是人源金黃色葡萄球菌接合子中未檢測到I類整合子，說明豬源沙門氏菌中I類整合子向人源革蘭氏陽性菌之間體外轉(zhuǎn)移可能性極小。

參考文獻(xiàn)：

[1] TAIWO S S， FADIORA S O， FAYEMIWO S A . High antimicrobial resistance among bacterial isolates of blood stream infections （BSI） in a Nigerian University Teaching Hospital [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2008，24（2）：231-236.

[2] 魏述永，吳鄧紅，劉世東.細(xì)菌基因盒-整合子系統(tǒng)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展， 2008，29（1）：53-56.

[3] BARBEI D A， BAHNSON P B， ISAACSON R， et al .Distribution of Salmonella in swine production ecosystems[J]. Food Prot ， 2002， 65（12）： 1861-1868.

[4] LABBATE M，CSES R J，STOKES H W.The integron gene cassette sys-tem：An active player in bacterial adaptation[J].Methods Molbiol，2009，532：103-125.

[5] WASTESON Y，ROE D E， FALK K. Characterization of tetracycline and erythromycin resistance in Actinobacillus pleuropneumoniae[J]. Veterinary Microbiology，1996，48：1-2.

[6] 劉渠，劉衡川，白松濤，等. 食品中大腸埃希氏菌、沙門氏菌整合子的耐藥性水平傳遞研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004，31（5） ：681-684.

[7] 魏峰，李杰，金山，等.雞源大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥性檢測[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（4）：90-91.

[8] KRAULAND M G， MARSH J W， PATERSON D L， et al. Integron-mediated multidrug resistance in a global collection of nontyphoidal Salmonella enterica isolates[J]. Emerging Infectious Diseases，2009，15（3）： 388-396.

[9] 練維，石翠，冒群，等. 整合子介導(dǎo)的沙門菌耐藥性水平播散機制的初步研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志，3013，25（1）：16-19.