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        原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌種提純復(fù)壯中的應(yīng)用

        2015-10-20 12:26:47李莎劉宇馬康馬元偉李明許峰
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年5期
        關(guān)鍵詞:白靈菇

        李莎+劉宇+馬康+馬元偉+李明+許峰

        摘要:為了探索原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌株提純復(fù)壯中的應(yīng)用,用退化的白靈菇菌株自10進行原生質(zhì)體單核化,得到121個原生質(zhì)體單核菌絲,通過平扳對峙試驗,選取2個菌落中間有突起的部位轉(zhuǎn)接至新PDA平板,鏡檢保留有鎖狀聯(lián)合的菌株,最后得到1株菌絲潔白、濃密的菌株,命名為自交45×49。通過測定菌絲生長速度、生物量、木質(zhì)纖維素降解酶的活性對復(fù)壯菌株進行評價,結(jié)果顯示,自交45×49菌株與白10菌株在液體PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d后的菌絲生物量分別為1.58、0.90mg/mL;一級種與二級種菌絲生長速度差異未達0.01顯著水平;自交45×49菌株的漆酶活性比白10強43.47%。由此證明原生質(zhì)體單核技術(shù)在白靈菇菌株的提純復(fù)壯中應(yīng)用的可行性。

        關(guān)鍵詞:菌種退化;白靈菇;原生質(zhì)體單核化;提純復(fù)壯

        中圖分類號:S646.101 文獻標志碼:A 文章編號:1002-1302(2015)05-0248-02

        白靈菇(Pleurotusnebrodensis)屬于擔子菌門傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬,肉質(zhì)鮮美,有“素鮑魚”的美稱,但是菌種退化問題一直困擾著白靈菇的育種進程。而菌種退化導(dǎo)致的產(chǎn)量、生物學(xué)效率、商品價值降低,畸形菇數(shù)量增加,經(jīng)濟效益減少也制約白靈菇的工廠化發(fā)展。那么,如何對菌種進行提純復(fù)壯成了關(guān)鍵問題。漆酶是含有4個銅的胞外氧化酶,屬于銅藍氧化酶,存在于菇、菌及植物中,可以選擇性地降解木質(zhì)素,而退化的菌株漆酶含量會下降;纖維素酶是一個由多種水解酶組成的復(fù)雜的酶系,產(chǎn)生纖維素酶的菌種易退化,退化后其產(chǎn)酶力明顯降低。本試驗采用原生質(zhì)體單核化技術(shù),以白10作為試驗材料,進行單核菌絲平板對峙試驗,獲得1株優(yōu)良復(fù)壯的菌株,命名為自交45×49。通過測定自交45×49和白10在PDA平板和大試管栽培料中的菌絲生長速度、生物量、漆酶和纖維素酶活力,以驗證提純復(fù)壯菌株的生長活力。

        1.材料與方法

        1.1菌種材料

        本試驗的白10菌株來自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所食用菌研究室。

        1.2供試培養(yǎng)基

        PDA綜合培養(yǎng)基、PDB液體培養(yǎng)基、RM再生培養(yǎng)基、大試管培養(yǎng)基的成分均見文獻[3]。

        1.3主要試劑的配制

        0.6mol/L甘露醇穩(wěn)滲液、2%溶壁酶溶液、滲透壓穩(wěn)定劑的配制參見文獻[4];ABTS溶液的配制參見文獻[5];3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)、0.05mol/L檸檬酸緩沖液(pH值5.0)、1%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液的配制見文獻[6]。

        1.4試驗方法

        (1)原生質(zhì)體單核化:具體過程參見文獻[7]。(2)菌絲生物量的測定:具體過程參見文獻[8]。(3)蛋白含量、漆酶活性的測定:具體過程分別參見文獻[5,9],其中蛋白含量采用BCA蛋白定量試劑盒測定。(4)纖維素酶活性的測定:具體過程參見文獻[6]。

        1.5數(shù)據(jù)分析

        試驗均設(shè)3次重復(fù),結(jié)果采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)之間的差異顯著性進行分析。

        2.結(jié)果與分析

        2.1自交45×49和白10的菌絲生長速度和生物量

        原生質(zhì)體提取后在顯微鏡下測定濃度100萬~1000萬個/mL,稀釋后涂板,挑取單個菌落鏡檢得到121個單核菌絲。平板對峙試驗后,獲得1株菌絲潔白、濃密的菌株,鏡檢有鎖狀聯(lián)合,命名為自交45×49(圖1)。

        2.1.1自交45×49和白10的生長速度由圖2可知,自交45×49和白10在平皿上的平均生長速度分別為10.17、10.70mm/d,且二者在0.01水平差異不顯著。由圖3可知,自交45×49和白10在大試管上的平均生長速度分別為3.0、2.81mm/d,且二者在0.01水平差異不顯著。

        2.1.2自交45×49和白10的菌絲生物量由圖4可知,自10、自交45×49平均菌絲生物量為0.9、1.58mg/mL,可見自交菌株的菌絲生物量明顯高于退化的白10菌株。

        2.2生物酶活性的測定

        2.2.1蛋白含量的測定蛋白含量與吸光度的回歸方程為y=0.0016x-0.0083,r2=0.999,蛋白含量在50~400μg/mL范圍內(nèi),溶液蛋白含量與D562nm呈線性關(guān)系。

        2.2.2葡萄糖標準曲線的繪制葡萄糖標準溶液濃度與吸糖含量在0.08~0.56mg/mL范圍內(nèi),葡萄糖含量與D540nm呈線性關(guān)系。

        2.2.3自10和自交45×49的蛋白含量和酶活力的測定結(jié)果由表1可知,自10的蛋白含量、漆酶活力、濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力分別為4.5%、25.64U/mg、1.43U/mg、1.23U/mg;自交45×49的相應(yīng)指標分別為4.1%、35.03U/mg、1.43U/mg、2.87U/mg。自交菌株發(fā)酵菌絲中的蛋白含量雖然降低了,但是生物酶活力卻相對增強了,其中漆酶活力更是比退化的白10菌株增強了36.62%,可見經(jīng)原生質(zhì)體單核化技術(shù)得到的自交菌株改善了退化菌株的菌絲生長活力,說明原生質(zhì)體單核化技術(shù)在一定程度上可以改善白靈菇菌株的退化現(xiàn)象。

        3.結(jié)論與討論

        樊曉琳等曾用原生質(zhì)體單核化技術(shù)提純復(fù)壯雙孢蘑菇As2796,并證明原生質(zhì)體單核化技術(shù)提純復(fù)壯菌株是最好的方法;譚琦等利用原生質(zhì)體單核化技術(shù),以香菇栽培種Lel和野生種70#為親本,通過原生質(zhì)單核體雜交選育出申香8號,在大面積推廣后成為優(yōu)良菌種;吳小平等將原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用于靈芝的雜交育種中獲得了24個優(yōu)良的雜交菌株;江玉姬等將原生質(zhì)體單核化技術(shù)應(yīng)用于金針菇的育種中,證明原生質(zhì)體單核化技術(shù)可為白色金針菇的品種改良提供一個新途徑。由此可見,原生質(zhì)體單核化技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食用菌育種領(lǐng)域,但是對菌種的提純復(fù)壯還未有更深入的了解。

        一般對菌種進行提純復(fù)壯采用的都是優(yōu)化培養(yǎng)基法,或是進行出菇再組織分離。優(yōu)化培養(yǎng)基法操作簡單、耗費時間短,但是效果不是很明顯;出菇再組織分離法效果明顯,但是周期比較長、過程復(fù)雜。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上采用原生質(zhì)體單核化技術(shù)提純復(fù)壯菌絲可以比更換培養(yǎng)基達到更好的效果,且比出菇試驗簡便,在很大程度上縮短了菌種復(fù)壯周期。

        本研究從菌絲形態(tài)、生長速度、菌絲生物量和生物酶活力方面分析了自交45×49和白10菌株的區(qū)別,結(jié)果表明,自交45×49的菌絲生長活力優(yōu)于退化的菌株,證明了原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌株提純復(fù)壯中應(yīng)用的可行性。endprint

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