高俊等

摘要：研究8種不同極性大孔吸附樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附、解吸性能，篩選出分離富集葛根素、大豆苷元的最佳樹脂HP20。利用HP20大孔吸附樹脂吸附富集葛根中2種異黃酮的過程為：上樣液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為6，然后采用HP20大孔吸附樹脂在5 ℃的條件下進(jìn)行吸附。結(jié)果表明，HP20大孔吸附樹脂對葛根素、大豆苷元的飽和吸附量分別為（71.78±0.75）、（21.77±0.01）mg/g；吸附飽和后用去離子水洗滌樹脂以除去雜質(zhì)，在25 ℃條件下用70%乙醇解吸，得葛根素、大豆苷元，解吸率分別為63.39%、80.68%，葛根素純度由8.62%提高到35.26%，大豆苷元純度由0.27%提高到10.17%。

關(guān)鍵詞：葛根素；大豆苷元；大孔樹脂；吸附；解吸；分離；富集；工藝條件

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0292-05

葛根是豆科類植物野葛[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]的根，是一種常用中藥材。我國有著豐富的葛根資源，主要分為粉葛、野葛兩大類，尤以野葛的分布最為廣泛，且野葛中異黃酮類化合物含量高，常作藥用。葛根享有“山人參”的美稱，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，葛根具有清熱解毒、改善微循環(huán)、降血壓、調(diào)節(jié)血脂等作用[1-2]。葛根素、大豆苷元是葛根中主要的藥物活性成分，臨床研究表明，葛根素對心腦血管疾病的治愈率達(dá)97.6%，且副作用低，深受患者歡迎；大豆苷元具有防止骨質(zhì)疏松作用，還能減輕婦女更年期綜合癥、降低冠心病的發(fā)病率、促進(jìn)神經(jīng)元的保護(hù)和再生[3-5]。隨著物質(zhì)生活日益豐富，心血管疾病患者不斷增多，以葛根異黃酮類化合物為原料的藥品是治療該類疾病的特效藥之一，因此，如何分離富集葛根提取液中的葛根素、大豆苷元成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

大孔樹脂是一類具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子有機(jī)聚合吸附劑，由于其具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、吸附選擇性獨(dú)特、吸附和解吸條件溫和、重復(fù)利用率高、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于皂苷、黃酮、生物堿等天然產(chǎn)物的分離純化[6-9]。目前葛根中異黃酮類化合物的分離富集方法多以葛根素為主，忽略了大豆苷元的市場應(yīng)用價(jià)值，造成一定程度上的資源浪費(fèi)[10-11]。本研究選用不同極性的大孔樹脂同時(shí)分離富集葛根提取液中的葛根素、大豆苷元，考察大孔樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附洗脫作用和過程動力學(xué)，并對優(yōu)選出的樹脂分離富集葛根素、大豆苷元的工藝條件進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

葛根[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]購自江蘇鎮(zhèn)江藥材市場，陰干、粉碎后保存?zhèn)溆?。對照品為葛根素、大豆苷元，Sigma公司產(chǎn)品；含量測定用色譜純甲醇、乙酸為J&K Chemical Ltd產(chǎn)品；去離子水為自制；大孔吸附樹脂HPD750、HPD600購自南開大學(xué)化工廠，HP20、D100、SP70、HPD722、HPD450A、HPD500購自鄭州勤實(shí)科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)儀器

Agilent 1260LC高效液相色譜儀配G1311-B四元泵、G1311-B自動進(jìn)樣器、G1316-A柱溫箱、G1314-F紫外檢測器，美國Agilent公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3大孔樹脂的預(yù)處理

在室溫條件下將樹脂用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡 24 h，每隔一段時(shí)間攪拌1次，每8 h更換1次乙醇溶液，之后用去離子水將樹脂洗至無乙醇味；用5%的HCl溶液將樹脂浸泡4 h后，用去離子水清洗樹脂直至清洗液pH值為7；用5%NaOH溶液將樹脂浸泡4 h后，用去離子水清洗樹脂直至清洗液pH值為7；最后用蒸餾水浸泡24 h。試驗(yàn)中所用大孔樹脂的性質(zhì)見表1。

1.4葛根提取液的制備

取自然陰干的葛根，粉碎過篩備用。以葛根粉末（60～80目）為原料，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取劑，按料液比1 g ∶8 mL在90 ℃條件下水浴回流提取2 h，重復(fù)提取3次，過濾并合并濾液。將濾液減壓蒸餾至無乙醇味，用去離子水分別配置成葛根素、大豆苷元含量為1.527、0.140 mg/mL的溶液備用。

1.5分析方法

采用高效液相色譜法檢測樣品液中葛根素、大豆苷元含量[12-15]。色譜條件：Agilent ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長250 nm；柱溫25 ℃；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動相：A相為含0.1%乙酸的乙腈溶液，B相為含0.1%乙酸的水溶液，流動相配比見表2。

1.6葛根素、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取5.00 mg葛根素標(biāo)準(zhǔn)品、 3.00 mg大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并于10 mL容量瓶中定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（500 μg/mL葛根素，300 μg/mL大豆苷元）。精確量取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用甲醇稀釋配制成以下濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液：250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg/mL葛根素；150.000、75.000、37.500、18.750、9.375 μg/mL大豆苷元，分別用0.22 μm濾膜過濾后按“1.4”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行檢測，每個濃度重復(fù)進(jìn)樣3次。

分別以葛根素、大豆苷元濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葛根素、大豆苷元回歸方程：y=28 118.05x+20.67（r2=0.999 8）、y=20 638.31x+84.16（r2=0.999 7）。濃度分別在10～300、5～250 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)葛根素、大豆苷元的濃度與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

1.7大孔樹脂分離富集葛根素、大豆苷元

1.7.1樹脂的篩選準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為 0.25 g 的不同型號的濕樹脂于100 mL錐形瓶中，加入30 mL葛根提取液，放入恒溫水浴振蕩器中。吸附條件：溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，吸附24 h達(dá)到吸附平衡后過濾，取 1 mL 濾液，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。按式（1）計(jì)算各樹脂的吸附量：

Qe=（C0-Ce）×Vi（1-M）m。（1）

式中：Qe為吸附質(zhì)在吸附劑中的平衡吸附量，mg/g；Ce為平衡時(shí)吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；C0為葛根提取液初始濃度，mg/mL；Vi為葛根提取液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g；M為樹脂的含水率，%。

將吸附飽和的大孔樹脂置于100 mL錐形瓶中，加入 10 mL 去離子水沖洗樹脂后，過濾棄去去離子水，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，放入水浴振蕩器中。解吸條件：溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，解吸24 h后分別取 1 mL 上清液，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。按式（2）計(jì)算各樹脂解吸率：

D=Cd×Vd（C0-Ce）Vi×100%。（2）

式中：D為樹脂的解吸率，%；Cd為解吸液中吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；Vd為解吸液的體積，mL；Ce為平衡時(shí)吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；C0為葛根提取液初始濃度，mg/mL；Vi為葛根提取液體積，mL。

1.7.2pH值對樹脂吸附性能的影響準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為0.25 g的不同型號的濕樹脂于100 mL錐形瓶中，加入30 mL不同pH值的葛根提取液（pH值分別為5、6、7、8、9，溶液的pH值用HCl、NaOH調(diào)節(jié)），放入恒溫水浴振蕩器中。吸附條件：溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，吸附24 h后分別取樣1 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.3解吸液乙醇濃度對樹脂解吸性能的影響準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為0.25 g的不同型號的濕樹脂于 100 mL 錐形瓶中，加入30 mL葛根提取液，放入恒溫水浴振蕩器中。設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，當(dāng)達(dá)到吸附平衡以后，過濾，用10 mL去離子水沖洗樹脂，之后加入10 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（60%、70%、80%、90%、100%），放入水浴振蕩器中，設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，解吸24 h分別取樣1mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.4樹脂的吸附動力學(xué)曲線分別稱取3份預(yù)處理過的、絕干質(zhì)量為2.5 g的大孔吸附樹脂，置于1 000 mL具塞錐形瓶中，分別將300 mL葛根提取液加入到裝有樹脂的錐形瓶中，并將錐形瓶放入水浴振蕩器中，設(shè)置溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，分別于0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00 h時(shí)取樣1 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.5樹脂的解吸動力學(xué)曲線分別稱取3份預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為2.5 g的大孔吸附樹脂，置于1 000 mL具塞錐形瓶中，分別將300 mL葛根提取液加入到裝有樹脂的錐形瓶中，并將錐形瓶放入水浴振蕩器中，設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min；當(dāng)達(dá)到吸附平衡以后，過濾，用去離子水沖洗樹脂，之后加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，放入水浴振蕩器中，設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，分別于5、10、20、30、40、50、60 min取樣1mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.6樹脂的吸附等溫曲線稱取若干份預(yù)處理好的HP20樹脂，每份絕干質(zhì)量0.25 g，分別加入30 mL不同濃度的葛根提取液，在5、25、45 ℃的條件下分別吸附2 h后取樣1 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。繪制出在不同溫度條件下的吸附等溫線，并利用Langrnuir方程進(jìn)行參數(shù)擬合。

1.7.7葛根素、大豆苷元純度的計(jì)算將HP20樹脂解吸液減壓濃縮至干，得葛根異黃酮粗品。稱取25 mg葛根異黃酮粗品，定容至25 mL的容量瓶中，取樣1 mL用0.22 μm濾膜過濾后，用HPLC檢測葛根素、大豆苷元的含量，并按式（3）計(jì)算其純度：

F=CfVfm×100%。（3）

式中：F為純度，%；Cf為溶液中吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；Vf為溶液的體積，mL；m為葛根異黃酮粗品的質(zhì)量，mg。

2結(jié)果與分析

2.1大孔吸附樹脂的吸附量、解吸率

不同大孔樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附和解吸性能有很大差異。如圖1-a所示，多數(shù)非極性、弱極性、中級性樹脂的吸附能力明顯優(yōu)于極性樹脂，這是因?yàn)闃渲瑢Ω鸶?、大豆苷元的吸附特性主要表現(xiàn)為通過范德華力進(jìn)行吸附，從而有利于非極性、弱極性、中級性樹脂的吸附[16]；HP20、HPD722、HPD450A型樹脂表現(xiàn)出了較好的吸附性能，對葛根素、大豆苷元的吸附量都很高，其中HP20樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附量分別達(dá)（61.78±0.36）、（12.77±0.02） mg/g。

如圖1-b所示，在解吸試驗(yàn)中，不同極性的樹脂對葛根素、大豆苷元的解吸能力有所不同。大孔樹脂對于葛根素的解吸能力大致隨著極性的升高而增強(qiáng)；而對于大豆苷元，大孔樹脂的解吸能力大致隨著極性的升高而降低，這可能是由于吸附作用力強(qiáng)，解吸起來就會困難。綜合考慮樹脂的吸附量和解吸率，HP20型樹脂對于葛根素、大豆苷元的吸附和解吸能力與其他樹脂相比較高，因此選用HP20型樹脂進(jìn)行上樣液pH值對樹脂吸附性能影響的試驗(yàn)。

2.2上樣液pH值對樹脂吸附性能的影響

吸附溶液的pH值是影響樹脂吸附性能的關(guān)鍵參數(shù)，這主要在于pH值影響溶質(zhì)的電離程度，從而影響溶質(zhì)與溶液之間的親和力。如圖2所示，當(dāng)pH值在5～6時(shí)，葛根素、大豆苷元的吸附量隨著pH值的升高而增加；當(dāng)pH值大于6