武軍元等

摘要：采用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)對(duì)采自新疆3個(gè)集約化養(yǎng)殖鹿場(chǎng)、1個(gè)散養(yǎng)鹿群的410份血清樣本進(jìn)行布氏桿菌特異性抗體檢測(cè)；采用分子生物學(xué)方法，根據(jù)GenBank公布的布氏桿菌外膜蛋白Omp25c的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)疑似布氏桿菌陽(yáng)性的10份羊水病料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，血清稀釋比例為1 ∶25時(shí)，平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)的抗體陽(yáng)性率分別為15.1%、14.6%，4份羊水樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上均觀察到預(yù)期149 bp大小的擴(kuò)增條帶，BLAST比對(duì)分析顯示該擴(kuò)增序列與布氏桿菌基因組的核苷酸序列同源性為100%，從而判定新疆集約化養(yǎng)殖的天山馬鹿存在布氏桿菌病的感染。

關(guān)鍵詞：布氏桿菌；天山馬鹿；平板凝集；試管凝集；Omp25c

中圖分類號(hào)：S852.61+2；S858.255.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0235-02

布氏桿菌?。╞rucellosis）又稱馬爾他熱、波狀熱，是由布氏桿菌屬（Brucella）細(xì)菌引起的人畜共患病。布氏桿菌可感染人類、多種家畜和野生動(dòng)物，引起相似的臨床癥狀與病理?yè)p傷。該病最典型的癥狀為懷孕母畜流產(chǎn)、空懷不育、子宮炎、乳房炎，以及公畜睪丸炎、關(guān)節(jié)炎等。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，中國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。全世界有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)存在和流行人畜共患布氏桿菌病，每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失約30億美元[1]。根據(jù)其宿主的嗜好性可將布氏桿菌分為豬、牛、羊、犬、綿羊附睪、沙林鼠種布魯氏菌6個(gè)種及20個(gè)型[2]。我國(guó)鹿群中流行的布魯氏菌主要為豬型、牛型、羊型、非典型布魯氏菌[3-4]。天山馬鹿是產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種，是國(guó)家二類保護(hù)動(dòng)物。目前，關(guān)于新疆天山馬鹿感染布氏桿菌的情況尚未見(jiàn)報(bào)道，更無(wú)應(yīng)用分子生物學(xué)手段對(duì)天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌流行病學(xué)的檢測(cè)及研究。通過(guò)對(duì)新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖、散養(yǎng)的天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查，以了解當(dāng)?shù)靥焐今R鹿的布氏桿菌感染狀況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1血清及病料來(lái)源410份血清樣本分別采自新疆地區(qū)3個(gè)集約化養(yǎng)殖鹿場(chǎng)、1個(gè)散養(yǎng)鹿群；10份疑似布氏桿菌陽(yáng)性的羊水病料采自新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖鹿場(chǎng)。

1.1.2試驗(yàn)菌株布氏桿菌疫苗株M5購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)公司。

1.1.3主要試劑及儀器設(shè)備HiPure Gel Pure DNA Kits，購(gòu)自Magen公司；pGEM-T Easy Vector，購(gòu)自Promega公司；Trans 2K DNA Markers、Trans Taq-T DNA Polymerase，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；布氏桿菌虎紅平板凝集抗原、布氏桿菌試管凝集抗原、布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布氏桿菌陰性參考血清為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。梯度PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機(jī)均為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1虎紅平板凝集試驗(yàn)虎紅平板凝集試驗(yàn)是一種快速、敏感的檢測(cè)方法，用于布氏桿菌病的田間篩選，具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》。

1.2.2試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)是一種特異、敏感的布氏桿菌病檢測(cè)方法，用于布氏桿菌病的診斷，具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》。

1.2.3布氏桿菌基因組DNA的制備將疑似布氏桿菌陽(yáng)性的羊水病料劃線接種于TSA瓊脂平板，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至TSB培養(yǎng)基。取1 mL TSB培養(yǎng)物以12 000 r/min離心5 min，棄上清。

以200 μL TE（1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.6）重懸沉淀，于95 ℃煮沸5 min，以12 000 r/min離心 10 min，上清即為細(xì)菌DNA模板。

1.2.4樣品的PCR檢測(cè)根據(jù)布氏桿菌特異性基因Omp25c的保守片段，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：Omp25c FP 5′-TTTGGATGAAAATAACGCC-3′；Omp25c RP 5′-ATTCGCCCCTGTTTCTCA-3′。

所采用的25 μL反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶（5 U）0.5 μL、上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L）、DNA模板2.0 μL、無(wú)RNA酶的水17.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆、測(cè)序采用HiPure Gel Pure DNA Kits試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)對(duì)電泳后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并純化，將純化回收的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy Vector。連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α（天根公司產(chǎn)品）并進(jìn)行氨芐青霉素抗性篩選。選擇抗性菌落增菌培養(yǎng)，并采用質(zhì)粒小提試劑盒從擴(kuò)增的細(xì)菌培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，將PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2結(jié)果與分析

2.1血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

用PBS溶液對(duì)采集的410份天山馬鹿血清依次進(jìn)行倍比稀釋（1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200），并分別采用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.2PCR檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用針對(duì)特異性基因Omp25c保守片段設(shè)計(jì)的引物，分別對(duì)疑似陽(yáng)性病料、對(duì)照疫苗菌株M5的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，10份疑似布氏桿菌陽(yáng)性的羊水病料中有4份呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為40%，在1.2%瓊脂糖凝膠上觀察到預(yù)期大小為149 bp的擴(kuò)增條帶。采用M13通用引物對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并將獲得的核苷酸序列進(jìn)行BLAST對(duì)比，證明所擴(kuò)增及克隆的核酸片段為布氏桿菌Omp25c保守的核苷酸序列。陽(yáng)性樣品的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，擴(kuò)增子測(cè)序序列的BLAST比對(duì)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

3結(jié)論與討論

布魯氏菌病是由布氏桿菌引起的一種人獸共患傳染病，布氏桿菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，具有逃避機(jī)體免疫保護(hù)的能力。對(duì)于布氏桿菌病的診斷，GB/T18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》規(guī)定的虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）一直是我國(guó)動(dòng)物布病檢測(cè)的經(jīng)典試驗(yàn)方法[5]。然而，對(duì)于受到免疫抑制且攜帶病原的宿主動(dòng)物，抗體水平很難達(dá)到有效的檢測(cè)滴度，需借助分子生物學(xué)方法來(lái)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的病原體，因此必須篩選布氏桿菌種間高度保守的目的基因，而Omp25c是目前最具代表性的布氏桿菌外膜蛋白之一，具有較強(qiáng)的免疫原性，且在布氏桿菌各種間高度保守[6-7]。以O(shè)mp25c外膜蛋白為研究對(duì)象，選取特異性較好的基因片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)布氏桿菌病原菌的檢測(cè)。

近年來(lái)，新疆地區(qū)多個(gè)畜種均有布氏桿菌病感染的報(bào)道[8-10]，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)厝诵蠼】导靶竽翗I(yè)的安全生產(chǎn)。天山馬鹿是產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種，是國(guó)家二類保護(hù)動(dòng)物。早期，野生天山馬鹿在新疆較為多見(jiàn)，隨著近年來(lái)市場(chǎng)對(duì)天山馬鹿所產(chǎn)鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿筋、鹿角膠等鹿產(chǎn)品需求的不斷擴(kuò)大，天山馬鹿在新疆呈現(xiàn)集約化養(yǎng)殖的趨勢(shì)。有文獻(xiàn)初步報(bào)道，新疆天山馬鹿由野生放養(yǎng)到與其他家畜混養(yǎng)，曾出現(xiàn)過(guò)布氏桿菌感染的病例[11-12]，然而上述流行病學(xué)調(diào)查研究均僅限于血清學(xué)水平，不能排除假陽(yáng)性、假陰性存在的情況。為系統(tǒng)了解新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后，布氏桿菌病在該畜群中的流行狀況，本研究采用血清學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)手段，對(duì)當(dāng)?shù)靥焐今R鹿布氏桿菌病的感染情況進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明，新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后確實(shí)出現(xiàn)了布氏桿菌病感染的病例。對(duì)血清樣品進(jìn)行布氏桿菌特異性抗體檢測(cè)時(shí)，平行采用虎紅平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)，然而以不同方法對(duì)同一批血清測(cè)得的陽(yáng)性率不同，可見(jiàn)僅靠血清學(xué)檢測(cè)抗體的方法難以對(duì)畜群感染布氏桿菌的程度進(jìn)行定論。以布氏桿菌高度保守的Omp25c外膜蛋白基因?yàn)檠芯繉?duì)象，從10份疑似布氏桿菌陽(yáng)性的羊水病料中篩選出4份陽(yáng)性病例，進(jìn)一步提供了布氏桿菌感染新疆天山馬鹿的證據(jù)。確定感染新疆天山馬鹿的布氏桿菌種型尚需進(jìn)一步研究，從而有針對(duì)性地對(duì)天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌病的防控。

參考文獻(xiàn)：

[1]Seleem M N，Boyle S M，Sriranganathan N. Brucellosis：a remerging zoonosis[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（3/4）：392-398.

[2]Díaz-Apancio E，Marin C，Alonso-Urmeneta B，et al. Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis in fection of goats[J]. Clin Microbiol，2004，32（5）：1159-1165.

[3]鄧小紅，曾政，王希良. 布魯氏菌pcDNA3.1-omp17.3基因疫苗的研制[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（6）：505-509.

[4]陳偉業(yè)，胡森，黃克和，等. IS711和omp2作為布氏桿菌種屬及種株間分子鑒別診斷標(biāo)記的研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（6）：676-680.

[5]鄭錦玲，蔣成硯，董仲生，等. 布氏桿菌病檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（6）：25-28.

[6]曲勍，王玉飛，喬鳳，等. Omp25c基因?qū)︸R耳他布魯菌疫苗株M5的毒力及免疫保護(hù)性的影響[J]. 生物技術(shù)通訊，2009，20（5）：639-642.

[7]Caro H P，F(xiàn)ernandez L L，de Miguel M J，et al. Role of the omp25/omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis[J]. Infection and Immunity，2007，75（8）：4050-4061.

[8]李玲，閆晶華，閆昊，等. 新疆畜間布魯氏菌病流行情況及防制技術(shù)研究[J]. 草食家畜，2012，156（3）：19-22.

[9]石琴，袁立崗，蒲敬偉，等. 山區(qū)牧場(chǎng)牛羊布魯氏菌病感染情況調(diào)查與分析[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2013，30（2）：40-41.

[10]張魯安，蘇貴成，李 杰，等. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜間布病監(jiān)測(cè)分析及防控對(duì)策[J]. 新疆農(nóng)墾科技，2012（4）：26-28.

[11]曾鵬武，李靈，陳勝文. 天山馬鹿布魯氏菌病的檢疫和防制[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，2004，34（1）：73-75.

[12]孟慶玲，楊?yuàn)^東，賈桂珍，等. 昌吉地區(qū)天山馬鹿布氏桿菌病血清學(xué)調(diào)查[J]. 塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，18（3）：32-33.

王海， 王康環(huán)， 蔣小松，等. 優(yōu)質(zhì)肉雞硫胺素含量以及TPK1基因的多態(tài)性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：237-239.