武軍元等

摘要：采用平板凝集試驗、試管凝集試驗對采自新疆3個集約化養(yǎng)殖鹿場、1個散養(yǎng)鹿群的410份血清樣本進行布氏桿菌特異性抗體檢測；采用分子生物學方法，根據(jù)GenBank公布的布氏桿菌外膜蛋白Omp25c的基因序列設計特異性引物，對疑似布氏桿菌陽性的10份羊水病料進行PCR擴增，并將擴增產物克隆到pGEM-T Easy Vector進行測序。結果表明，血清稀釋比例為1 ∶25時，平板凝集試驗、試管凝集試驗的抗體陽性率分別為15.1%、14.6%，4份羊水樣本的PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠上均觀察到預期149 bp大小的擴增條帶，BLAST比對分析顯示該擴增序列與布氏桿菌基因組的核苷酸序列同源性為100%，從而判定新疆集約化養(yǎng)殖的天山馬鹿存在布氏桿菌病的感染。

關鍵詞：布氏桿菌；天山馬鹿；平板凝集；試管凝集；Omp25c

中圖分類號：S852.61+2；S858.255.1+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0235-02

布氏桿菌?。╞rucellosis）又稱馬爾他熱、波狀熱，是由布氏桿菌屬（Brucella）細菌引起的人畜共患病。布氏桿菌可感染人類、多種家畜和野生動物，引起相似的臨床癥狀與病理損傷。該病最典型的癥狀為懷孕母畜流產、空懷不育、子宮炎、乳房炎，以及公畜睪丸炎、關節(jié)炎等。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，中國將其列為二類動物疫病。全世界有170多個國家和地區(qū)存在和流行人畜共患布氏桿菌病，每年因該病造成的經濟損失約30億美元[1]。根據(jù)其宿主的嗜好性可將布氏桿菌分為豬、牛、羊、犬、綿羊附睪、沙林鼠種布魯氏菌6個種及20個型[2]。我國鹿群中流行的布魯氏菌主要為豬型、牛型、羊型、非典型布魯氏菌[3-4]。天山馬鹿是產于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種，是國家二類保護動物。目前，關于新疆天山馬鹿感染布氏桿菌的情況尚未見報道，更無應用分子生物學手段對天山馬鹿進行布氏桿菌流行病學的檢測及研究。通過對新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖、散養(yǎng)的天山馬鹿進行布氏桿菌病流行病學調查，以了解當?shù)靥焐今R鹿的布氏桿菌感染狀況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1血清及病料來源410份血清樣本分別采自新疆地區(qū)3個集約化養(yǎng)殖鹿場、1個散養(yǎng)鹿群；10份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料采自新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖鹿場。

1.1.2試驗菌株布氏桿菌疫苗株M5購自新疆天康畜牧生物技術公司。

1.1.3主要試劑及儀器設備HiPure Gel Pure DNA Kits，購自Magen公司；pGEM-T Easy Vector，購自Promega公司；Trans 2K DNA Markers、Trans Taq-T DNA Polymerase，均購自北京全式金生物技術有限公司；質粒小提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；布氏桿菌虎紅平板凝集抗原、布氏桿菌試管凝集抗原、布氏桿菌標準陽性血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布氏桿菌陰性參考血清為筆者所在實驗室保存。梯度PCR儀、全自動凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機均為德國Eppendorf公司產品。

1.2方法

1.2.1虎紅平板凝集試驗虎紅平板凝集試驗是一種快速、敏感的檢測方法，用于布氏桿菌病的田間篩選，具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動物布魯氏菌病診斷技術》。

1.2.2試管凝集試驗試管凝集試驗是一種特異、敏感的布氏桿菌病檢測方法，用于布氏桿菌病的診斷，具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動物布魯氏菌病診斷技術》。

1.2.3布氏桿菌基因組DNA的制備將疑似布氏桿菌陽性的羊水病料劃線接種于TSA瓊脂平板，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至TSB培養(yǎng)基。取1 mL TSB培養(yǎng)物以12 000 r/min離心5 min，棄上清。

以200 μL TE（1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.6）重懸沉淀，于95 ℃煮沸5 min，以12 000 r/min離心 10 min，上清即為細菌DNA模板。

1.2.4樣品的PCR檢測根據(jù)布氏桿菌特異性基因Omp25c的保守片段，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列為：Omp25c FP 5′-TTTGGATGAAAATAACGCC-3′；Omp25c RP 5′-ATTCGCCCCTGTTTCTCA-3′。

所采用的25 μL反應體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶（5 U）0.5 μL、上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L）、DNA模板2.0 μL、無RNA酶的水17.0 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應結束后，取5 μL反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結果。

1.2.5PCR擴增產物的純化、克隆、測序采用HiPure Gel Pure DNA Kits試劑盒，按照說明書對電泳后的PCR產物進行回收并純化，將純化回收的PCR產物連接至pGEM-T Easy Vector。連接產物按常規(guī)方法轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α（天根公司產品）并進行氨芐青霉素抗性篩選。選擇抗性菌落增菌培養(yǎng)，并采用質粒小提試劑盒從擴增的細菌培養(yǎng)物中提取質粒，將PCR鑒定為陽性的重組質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2結果與分析

2.1血清學檢測結果

用PBS溶液對采集的410份天山馬鹿血清依次進行倍比稀釋（1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200），并分別采用平板凝集試驗、試管凝集試驗進行檢測，檢測結果見表1、表2。

2.2PCR檢測結果

應用針對特異性基因Omp25c保守片段設計的引物，分別對疑似陽性病料、對照疫苗菌株M5的DNA模板進行PCR擴增。結果顯示，10份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料中有4份呈陽性，陽性率為40%，在1.2%瓊脂糖凝膠上觀察到預期大小為149 bp的擴增條帶。采用M13通用引物對PCR鑒定為陽性的重組質粒進行測序，并將獲得的核苷酸序列進行BLAST對比，證明所擴增及克隆的核酸片段為布氏桿菌Omp25c保守的核苷酸序列。陽性樣品的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，擴增子測序序列的BLAST比對分析結果見圖2。

3結論與討論

布魯氏菌病是由布氏桿菌引起的一種人獸共患傳染病，布氏桿菌是一種兼性胞內寄生菌，具有逃避機體免疫保護的能力。對于布氏桿菌病的診斷，GB/T18646—2002《動物布魯氏菌病診斷技術》規(guī)定的虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）一直是我國動物布病檢測的經典試驗方法[5]。然而，對于受到免疫抑制且攜帶病原的宿主動物，抗體水平很難達到有效的檢測滴度，需借助分子生物學方法來檢測動物體內的病原體，因此必須篩選布氏桿菌種間高度保守的目的基因，而Omp25c是目前最具代表性的布氏桿菌外膜蛋白之一，具有較強的免疫原性，且在布氏桿菌各種間高度保守[6-7]。以Omp25c外膜蛋白為研究對象，選取特異性較好的基因片段設計引物，進行動物體內布氏桿菌病原菌的檢測。

近年來，新疆地區(qū)多個畜種均有布氏桿菌病感染的報道[8-10]，嚴重威脅當?shù)厝诵蠼】导靶竽翗I(yè)的安全生產。天山馬鹿是產于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種，是國家二類保護動物。早期，野生天山馬鹿在新疆較為多見，隨著近年來市場對天山馬鹿所產鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿筋、鹿角膠等鹿產品需求的不斷擴大，天山馬鹿在新疆呈現(xiàn)集約化養(yǎng)殖的趨勢。有文獻初步報道，新疆天山馬鹿由野生放養(yǎng)到與其他家畜混養(yǎng)，曾出現(xiàn)過布氏桿菌感染的病例[11-12]，然而上述流行病學調查研究均僅限于血清學水平，不能排除假陽性、假陰性存在的情況。為系統(tǒng)了解新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后，布氏桿菌病在該畜群中的流行狀況，本研究采用血清學與分子生物學相結合的技術手段，對當?shù)靥焐今R鹿布氏桿菌病的感染情況進行系統(tǒng)的流行病學調查。結果表明，新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后確實出現(xiàn)了布氏桿菌病感染的病例。對血清樣品進行布氏桿菌特異性抗體檢測時，平行采用虎紅平板凝集試驗與試管凝集試驗，然而以不同方法對同一批血清測得的陽性率不同，可見僅靠血清學檢測抗體的方法難以對畜群感染布氏桿菌的程度進行定論。以布氏桿菌高度保守的Omp25c外膜蛋白基因為研究對象，從10份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料中篩選出4份陽性病例，進一步提供了布氏桿菌感染新疆天山馬鹿的證據(jù)。確定感染新疆天山馬鹿的布氏桿菌種型尚需進一步研究，從而有針對性地對天山馬鹿進行布氏桿菌病的防控。

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