摘要：分析山羊卵泡數(shù)量對卵母細胞體外成熟的影響，根據(jù)卵泡數(shù)量將卵巢分為3組，探討卵泡多少對卵母細胞體外成熟的影響。卵泡數(shù)目大于14個的設(shè)為Ⅰ組，卵泡數(shù)目介于8～14個之間的設(shè)為Ⅱ組，卵泡數(shù)目在1～7個之間的設(shè)為Ⅲ組。3組卵巢來源的卵母細胞體外成熟率分別為61.68%、70.26%、63.09%；Ⅱ組的卵母細胞體外成熟率顯著高于其他2組。3組之間孤雌激活胚、克隆胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率無顯著差異。來源于卵泡數(shù)介于8～14個卵巢的卵母細胞體外成熟率最高，卵巢卵泡數(shù)量僅影響卵母細胞的體外成熟率，對發(fā)育能力無影響。

關(guān)鍵詞：山羊；卵巢；卵母細胞；體外成熟

中圖分類號： S827.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0232-03

卵母細胞體外成熟是在體外人工設(shè)定的條件下，初級卵母細胞經(jīng)過一系列的生長發(fā)育最終形成具有受精能力的MⅡ期成熟卵母細胞的過程。卵母細胞體外成熟可充分利用卵巢豐富的卵母細胞資源用于體外受精、體細胞克隆、轉(zhuǎn)基因動物研究以及發(fā)育生物學(xué)機理等研究，是現(xiàn)代胚胎生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。通過超數(shù)排卵等方法獲取成熟卵母細胞的成本較高，且資源有限，遠遠滿足不了當(dāng)前科研、生產(chǎn)的需求。目前主要的解決手段是采集屠宰場卵巢，獲取大量未成熟的卵母細胞，通過體外培養(yǎng)成熟，進而應(yīng)用于科研、生產(chǎn)。山羊卵母細胞體外成熟影響因素較多，主要包括運輸溫度、卵丘顆粒細胞、卵泡直徑、激素、小分子化合物、培養(yǎng)時間等。屈雷等[1]、孫新明等[2]研究認為，卵巢運輸溫度在25 ℃左右時，卵母細胞成熟率顯著高于運輸溫度接近37 ℃時的成熟率。劉海軍等研究表明，卵丘顆粒細胞對卵母細胞體外成熟具有顯著影響，卵丘顆粒細胞層數(shù)在3層以上的卵母細胞成熟率最好[3]。葉華虎等發(fā)現(xiàn)，直徑小于1.5 mm卵泡內(nèi)的卵母細胞僅有個別能完成成熟和卵裂，大于1.5 mm卵泡內(nèi)的卵母細胞具有核成熟能力，直徑大于2.5 mm卵泡內(nèi)的卵母細胞能較好地支持胚胎繼續(xù)發(fā)育[4]。Kordan等研究表明，促卵泡素和促黃體素聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高山羊卵母細胞成熟率和受精后胚胎的發(fā)育率[5]。王艾平等研究表明，表皮生長因子對卵母細胞的體外成熟和卵裂發(fā)育具有明顯的促進作用[6]。王超等發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h或26 h的卵母細胞體外成熟率最好[7]。許杰等研究表明，繁殖季節(jié)卵母細胞的成熟率明顯高于非繁殖季節(jié)[8]。屠宰場采集的山羊卵巢上卵泡數(shù)量差異較大，這可能與山羊年齡、生理狀態(tài)、營養(yǎng)水平等因素有關(guān)。卵泡數(shù)量是否影響卵母細胞的體外成熟以及后期的胚胎發(fā)育尚不清楚，也未見相關(guān)研究報道。本試驗分析了不同卵泡數(shù)量卵巢來源的卵母細胞體外成熟情況、孤雌激活胚發(fā)育能力以及克隆胚發(fā)育能力，探討卵泡數(shù)量對山羊卵母細胞體外成熟的影響，旨在為山羊體細胞克隆、轉(zhuǎn)基因山羊及其他胚胎工程研究提供參考。

1材料與方法

1.1試劑

本試驗所用試劑如無特殊說明均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1卵巢分組自當(dāng)?shù)赝涝讏霾杉窖蚵殉玻⒓捶湃霟o菌的生理鹽水（含青霉素、硫酸鏈霉素各100 IU/mL）中，3 h內(nèi)運至實驗室，卵巢到達實驗室時的溫度為23～28 ℃。將卵巢用28 ℃滅菌生理鹽水（含硫酸慶大霉素100 IU/mL）反復(fù)沖洗3次，剪去輸卵管等附屬組織，再用生理鹽水反復(fù)清洗干凈，計算卵巢表面卵泡數(shù)量，共統(tǒng)計100個卵巢，確定卵泡數(shù)量的最大值、最小值，對最大值與最小值的差值進行等分，最終確定卵泡數(shù)量大于14個的卵巢為Ⅰ組，介于8～14個之間的為Ⅱ組，介于1～7個之間的為Ⅲ組。

1.2.2卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)將分組的卵巢置于加有撿卵液的平皿中，用手術(shù)刀片切割2～6 mm卵泡，使得卵母細胞隨卵泡液進入撿卵液，最后在體視顯微鏡下收集卵丘卵母細胞復(fù)合體（cumulus oocytes complexs，COCs）。撿卵液為TCM199（GIBCO）培養(yǎng)液。將挑選的COCs用37 ℃預(yù)熱2 h的卵母細胞體外成熟液洗3次，轉(zhuǎn)移到含2 mL成熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，在38.5 ℃、5%（體積分數(shù)）CO2、最大飽和濕度中培養(yǎng)23 h。卵母細胞體外基礎(chǔ)成熟液：TCM199培養(yǎng)液添加 0.22 mg/L 丙酮酸鈉、10 μg/mL FSH（寧波第二激素廠）、20 μg/mL LH（寧波第二激素廠）、1 μg/mL 17β-E2、20%胎牛血清（GIBCO），同時添加1%（體積分數(shù)）的轉(zhuǎn)鐵蛋白-胰島素-亞硒酸鈉（ITS）、10 ng/mL EGF。

1.2.3卵母細胞體外成熟率的統(tǒng)計卵母細胞成熟培養(yǎng)后，將COCs移入3 g/L透明質(zhì)酸酶溶液中，用移液槍反復(fù)吹打卵母細胞，去除外周顆粒細胞，用操作液洗3次，操作液為TCM199添加20%的胎牛血清，最后于顯微鏡下挑選具有第1極體的卵母細胞，具有極體的細胞與培養(yǎng)細胞的比值即為成熟率。

1.2.4手工克隆胚的構(gòu)建山羊手工克隆胚的構(gòu)建參照于鴻浩等的方法[9-10] 進行。利用鏈酶蛋白酶去除卵母細胞透明帶，將其轉(zhuǎn)入操作液中恢復(fù)15 min以上，然后將其轉(zhuǎn)移至含有細胞松馳素B的操作液中進行手工去核，去核時利用胚胎切割刀切除靠近極體部位三分之一左右的卵母細胞胞質(zhì)。收集無核的卵母細胞胞質(zhì)作為受體，40 d P4～P6代陜北白絨山羊胎兒成纖維細胞為供核細胞。分別轉(zhuǎn)移受體細胞、供體細胞至植物血凝素溶液中，形成2個受體細胞夾雜1個供體細胞的復(fù)合體。細胞復(fù)合體經(jīng)電融合后形成克隆胚，再用ionomycin、6-DMAP聯(lián)合激活。

1.2.5克隆胚的培養(yǎng)將激活的克隆胚胎移入G1胚胎培養(yǎng)液（上海內(nèi)湖國際貿(mào)易有限公司）中進行體外培養(yǎng)。48 h后檢查卵裂情況，將形態(tài)良好的分裂卵移入G2培養(yǎng)液（上海內(nèi)湖國際貿(mào)易有限公司）中，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天，檢查胚胎發(fā)育情況?？寺∨吲囵B(yǎng)條件為38.5 ℃、5%（體積分數(shù)）CO2、最大飽和濕度。

1.2.6成熟卵母細胞孤雌激活將挑選的成熟卵母細胞轉(zhuǎn)移到含5 μmol/L ionomycin 的TCM199培養(yǎng)液中激活5 min，用操作液洗3次，最后轉(zhuǎn)移到2.5 mmol/L 6-甲基氨基嘌呤培養(yǎng)液中，在38.5 ℃、5%CO2、最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中作用4 h，按照克隆胚培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同卵巢來源的卵母細胞體外成熟率

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組卵巢來源的卵母細胞體外成熟率分別為6168%、70.26%、63.09%。Ⅱ組卵母細胞體外成熟率顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組。Ⅰ組、Ⅲ組之間成熟率無顯著差異2.3不同卵巢來源的卵母細胞孤雌激活囊胚率

孤雌激活培養(yǎng)至第6天觀察囊胚發(fā)育情況。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組孤雌激活囊胚發(fā)育率分別為20.89%、18.19%、21.60%。3組之間差異不顯著（表3）。表3不同卵巢來源的卵母細胞孤雌激活囊胚率

2.4克隆胚卵裂率

不同卵巢來源的成熟卵母細胞經(jīng)手工克隆技術(shù)制備成體細胞克隆胚，克隆胚培養(yǎng)48 h，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組卵裂率分別為73.37%、72.53%、73.56%。3組之間差異不顯著（表4）。表4不同卵巢來源的卵母細胞克隆胚卵裂率

組別 卵裂率 （%）重復(fù)1 重復(fù)2 重復(fù)3 重復(fù)4 重復(fù)5 平均Ⅰ7572.7370.276583.8773.37±6.94aⅡ66.6770.2773.6878.1373.9172.53±4.30aⅢ67.7481.5878.137070.3773.56±5.95a

2.5克隆胚囊胚發(fā)育率

克隆胚培養(yǎng)至第6天觀察發(fā)育情況，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組克隆胚囊胚發(fā)育率分別為12.82%、12.06%、10.88%，3組之間差異不顯著（表5）。表5不同卵巢來源的卵母細胞克隆胚囊胚發(fā)育率

3結(jié)論與討論

哺乳動物卵母細胞成熟過程非常復(fù)雜，主要包括卵母細胞核成熟、胞質(zhì)成熟。卵母細胞核成熟過程主要表現(xiàn)為生發(fā)泡破裂、MⅠ期赤道板的形成、同源染色體分離、MⅡ期紡錘體形成、第一極體排出、受精之后第二極體的排出。卵母細胞體外成熟過程中，生發(fā)泡破裂代表卵母細胞減數(shù)分裂啟動，第一極體排出標志著卵母細胞體外成熟，可以受精。與核成熟相比，胞質(zhì)成熟更為復(fù)雜，包括卵母細胞內(nèi)部各細胞器形態(tài)改變和功能建立以及供減數(shù)分裂與早期胚胎發(fā)育相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯與修飾，卵母細胞只有核與胞質(zhì)都充分成熟時才能成功受精，支持胚胎發(fā)育[11]。本研究以排出的第一極體為標準判斷卵母細胞核是否成熟，結(jié)果表明，不同卵巢來源的卵母細胞核體外成熟明顯不同，來源于Ⅱ組卵巢的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)后第一極體排出率顯著高于其他來源的卵母細胞；以孤雌激活胚和體細胞克隆胚的卵裂率、囊胚發(fā)育率判斷不同卵巢來源的卵母細胞胞質(zhì)成熟情況，結(jié)果表明，不同來源的體外成熟卵母細胞支持孤雌激活胚、體細胞克隆胚發(fā)育的能力是相同的?？梢?，山羊卵泡數(shù)量僅影響卵母細胞的核成熟率。卵母細胞成熟發(fā)育過程中，激活細胞核功能非常重要[12]。從單層扁平顆粒細胞包圍的卵母細胞到早期有腔卵泡階段的卵母細胞，其核仁是由染色質(zhì)絲纏繞而形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著rRNA合成的增加，核仁由RNA合成場所轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA貯存場所[13]。此外，核孔越來越明顯，密度增加，核周隙越來越難以分辨。電鏡結(jié)果顯示，生發(fā)泡期卵母細胞的核仁由顆粒性纖維成分、空泡及纖維中心組成，染色質(zhì)高度疏松，有明顯的核膜、核仁，核仁正在致密化或已發(fā)生致密化。只有核仁完全致密化，核仁周圍有染色質(zhì)相伴分布，卵母細胞才獲得恢復(fù)減數(shù)分裂的能力[13-14]。卵母細胞成熟培養(yǎng)開始后不久，核膜先是有輕微打折，核膜孔消失；與核膜分解行為同步，染色體擴散，顯著凝集在核膜內(nèi)緣；然后發(fā)生核膜破裂，直至完全解散，加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，核內(nèi)物質(zhì)與核質(zhì)混合，此過程即為生發(fā)泡破裂[15]。卵母細胞發(fā)生生發(fā)泡破裂，完成第1次減數(shù)分裂后，形成次級卵母細胞進行至第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ期），并排出第一極體。因此深入研究挖掘卵泡數(shù)量對核成熟的影響機制應(yīng)以細胞核形態(tài)、功能變化為切入點。卵巢卵泡數(shù)量差異形成可能與動物個體年齡、生理狀態(tài)、營養(yǎng)水平有關(guān)，但由于屠宰場屠宰的動物來源較多、年齡和生理狀態(tài)等不確定性導(dǎo)致探尋卵巢卵泡數(shù)量差異成因較為困難。本研究結(jié)果表明，山羊卵巢卵泡數(shù)量對山羊卵母細胞體外成熟率具有影響，卵泡數(shù)量為8～14個時卵巢來源卵母細胞體外成熟率最高。建議山羊體細胞克隆、轉(zhuǎn)基因動物制備、體外受精等胚胎工程研究選擇收集此類卵巢中的卵母細胞作為試驗材料。

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