蔣桂芳++宋力

摘要：采用抑制菌絲生長速率法測定放線菌F2發(fā)酵液的抑菌活性及發(fā)酵液的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2發(fā)酵液對辣椒炭疽病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，且在低溫貯藏下仍有很好的抑菌效果，在偏酸性或偏堿性條件下穩(wěn)定，抗熱性較差，具有較強(qiáng)的抗紫外線能力，該活性物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的分配率較高，為一種酯溶-水溶性抗生素。

關(guān)鍵詞：放線菌；發(fā)酵液；活性物質(zhì)；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： S432.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0184-02

辣椒炭疽病（Colletotrichum capsici）是危害甜椒、辣椒生產(chǎn)的主要病害之一。目前，辣椒炭疽病的防治主要集中于施用化學(xué)農(nóng)藥及抗病品種選育等農(nóng)業(yè)措施，大量化學(xué)農(nóng)藥的長期使用導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、病蟲害抗性增加、環(huán)境污染等問題，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[1]。農(nóng)用抗生素是微生物產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，可用來殺蟲、滅菌、除草及調(diào)節(jié)作物生長發(fā)育的一類微生物農(nóng)藥[2]。隨著環(huán)境保護(hù)、綠色食品及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，農(nóng)用抗生素以其選擇性強(qiáng)、高效低毒、殘留短等優(yōu)點(diǎn)，正日益受到人們的重視。目前，已發(fā)現(xiàn)的抗生素中大約有2/3由放線菌產(chǎn)生，從土壤中分離具有農(nóng)用活性的放線菌是目前微生物農(nóng)藥開發(fā)的一個(gè)重要途徑[3]。本研究從重慶地區(qū)的土壤中分離篩選出1株對辣椒炭疽病具較強(qiáng)抑菌活性的放線菌F2，對該拮抗菌發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以便為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試菌株

拮抗放線菌F2和辣椒炭疽病菌由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室自行分離保存。

1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：用于辣椒炭疽病菌培養(yǎng)及抑菌試驗(yàn)。高氏一號(hào)培養(yǎng)基：用于放線菌F2培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基：20 g可溶性淀粉，0.5 g K2HPO4，1 g KNO3，0.5 g NaCl，0.5 g MgSO4·7H2O，0.01 g FeSO4·7H2O，1 000 mL H2O，pH值7.2～7.4。發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g大豆粉（沸水煮30 min，紗布過濾后保留濾液），10 g蔗糖，5 g可溶性淀粉，2 g蛋白胨，2 g酵母膏，2 g NaCl，1 g CaCO3，0.5 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，1 000 mL H2O，pH值 7.0。

1.3培養(yǎng)方法

種子液制備：挑取活化菌種F2，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)48 h作為活化的種子液。發(fā)酵液的制備：取1 mL種子液接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d。將發(fā)酵液經(jīng)粗濾后再經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm）過濾，得到無菌發(fā)酵濾液，無菌容器保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4菌株F2發(fā)酵液中活性產(chǎn)物的抑菌作用測定

采用菌絲生長速率法[4-5]，以辣椒炭疽病菌為檢測菌，測定菌株F2發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的抑菌作用。將菌株F2的發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1 ∶3混勻，倒平板，待凝固后將辣椒炭疽病菌菌餅（8 mm）倒置放在平板中央，每處理3次重復(fù)，以無菌水和PDA培養(yǎng)液處理為對照。培養(yǎng)96 h后，用“十”字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑制率：抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.5F2菌株發(fā)酵液性質(zhì)測定[6-10]

1.5.1熱穩(wěn)定性試驗(yàn)將F2菌株發(fā)酵液經(jīng)40、50、60、70、80、90、100 ℃分別處理30 min，以未處理的發(fā)酵液為對照，用抑制菌絲生長速率法測定抑菌活性，重復(fù)3次。

1.5.2pH值穩(wěn)定性試驗(yàn)將F2菌株發(fā)酵液用1 mol/L NaOH溶液和l mol/L HCl溶液分別調(diào)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10，并于4 ℃冰箱中過夜，然后將各發(fā)酵液的pH值調(diào)回至原發(fā)酵液pH值為6.5，以未處理的發(fā)酵液為對照，用抑制菌絲生長速率法測定抑菌活性，重復(fù)3次。

1.5.3紫外照射對發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響將F2菌株發(fā)酵液于254 nm紫外燈下分別照射5、10、15、20、25、30 min后，以未處理的發(fā)酵液為對照，用抑制菌絲生長速率法測定抑菌活性，重復(fù)3次。

1.5.4儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)將F2菌株發(fā)酵液在4 ℃和室溫（25 ℃）條件下分別保存3、7、15 d后，以未處理的發(fā)酵液為對照，用抑制菌絲生長速率法測定抑菌活性，重復(fù)3次。

1.5.5活性物質(zhì)萃取試驗(yàn)取40 mL發(fā)酵液分成4份，分別加入等體積的正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚，在磁力攪拌器上攪拌均勻，于分液漏斗中靜置過夜。以未處理的發(fā)酵液為對照，用抑制菌絲生長速率法測定抑菌活性，重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1菌株F2發(fā)酵液對辣椒炭疽病菌的抑制作用

將拮抗放線菌F2的發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基混合制平板，接種辣椒炭疽病菌培養(yǎng)4 d。與對照相比，處理組平板上炭疽病菌株生長緩慢，菌落邊緣蔓延不明顯，經(jīng)測定該發(fā)酵液的抑菌率達(dá)到81.81%（圖1）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)2發(fā)酵液對辣椒炭疽病菌絲生長有顯著的拮抗作用。

2.2溫度對穩(wěn)定性的影響

隨著處理溫度升高，F(xiàn)2發(fā)酵液的抑菌活性緩慢下降，與對照比較，在70 ℃條件下抑菌率為60%以上，但70 ℃后發(fā)酵液的抑菌效果明顯降低，90 ℃處理后抑菌率降低到27%（圖2）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)2發(fā)酵液中生物活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性較弱，高溫會(huì)對其活性造成嚴(yán)重影響。

2.3pH值對穩(wěn)定性的影響

在室溫下F2發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物在酸性條件下抑菌活性較穩(wěn)定，pH值在3～5范圍內(nèi)，發(fā)酵液活性代謝產(chǎn)物的抑菌活性與對照發(fā)酵液相近，穩(wěn)定性較好。隨著堿性增強(qiáng)，抑菌率呈下降趨勢，但幅度不大，pH值在10下依然保持著較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌率為72.7%（圖3）。因此，F(xiàn)2發(fā)酵濾液pH值在3～10范圍內(nèi)，對酸堿具有較好的穩(wěn)定性，但要注意控制pH值范圍，以盡量減少活性成分的損失。

2.4紫外照射對穩(wěn)定性的影響

在紫外線照射5～30 min的情況下，隨著紫外線照射時(shí)間的增長，活性物質(zhì)的抑菌率有下降趨勢，經(jīng)過半個(gè)小時(shí)照射，活性物質(zhì)的抑菌率為63.6%，與對照比較下降幅度小于5%（圖4）。以上結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物對紫外線不敏感，有較強(qiáng)的抗紫外線照射的能力，可以用紫外光適當(dāng)照射發(fā)酵液來殺滅雜菌。

2.5儲(chǔ)藏時(shí)間對穩(wěn)定性的影響

在室溫與冷藏條件下活性物質(zhì)抑菌率都呈下降趨勢，但冷藏條件下抑菌率下降緩慢，經(jīng)15 d儲(chǔ)藏后抑菌率為7272%，其抑菌活性變化均不明顯。而室溫條件下儲(chǔ)藏3 d時(shí)活性明顯降低，經(jīng)過15 d儲(chǔ)藏后抑菌率為63.6%，與對照相比下降了9.09百分點(diǎn)（圖5）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)2發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物儲(chǔ)藏穩(wěn)定性較好，且低溫儲(chǔ)藏效果更好。

2.6不同有機(jī)溶劑對活性物質(zhì)萃取的影響

活性物質(zhì)在原始pH值條件下能被三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚及正丁醇萃取，且萃取效果較明顯，大部分抑菌活性物質(zhì)都進(jìn)入到有機(jī)相中，只有石油醚萃取活性物質(zhì)能力較弱（表1）。根據(jù)相似相溶原理，可大致判斷該活性物質(zhì)極性較強(qiáng)。此外，該活性物質(zhì)既能溶于溶媒又能溶于水，是一種酯溶-水溶性抗生素，且乙酸乙酯、正丁醇的萃取效果比三氯甲烷和石油醚的效果好。

1發(fā)酵上清液萃取試驗(yàn)結(jié)果

萃取溶劑生長抑菌率（%）水相有機(jī)相三氯甲烷18.1977.27乙酸乙酯63.6381.81石油醚81.8127.28正丁醇54.5581.813結(jié)論

菌株F2發(fā)酵液中的活性物質(zhì)對辣椒炭疽病菌有很好的抑制作用，菌絲生長抑制率達(dá)到80%以上，對用于防治辣椒炭疽病具有較高潛在價(jià)值。

菌株F2發(fā)酵液活性物質(zhì)對高溫的穩(wěn)定性差，對酸堿具有較好的穩(wěn)定性，有較強(qiáng)的抗紫外線能力，耐低溫貯藏。

菌株F2發(fā)酵液經(jīng)初步處理，采用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取活性物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的分配率較高，是一種酯溶-水溶性抗生素，可進(jìn)一步分離純化應(yīng)用于辣椒炭疽病的生物防治。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣桂芳，宋力. 辣椒炭疽病生物防治技術(shù)的研究與展望[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（11）：2481-2484，2485.

[2]朱昌雄，宋淵. 我國農(nóng)用抗生素的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢探討[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2006，8（6）：17-19.

[3]沈寅初. 農(nóng)用抗生素研究開發(fā)新進(jìn)展[J]. 植保技術(shù)與推廣，1997，19（6）：35-37.

[4]張玲玲，董美玉，許鳳春，等. 放線菌C3-11的抗菌活性篩選及發(fā)酵液穩(wěn)定性研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：109-110，113.

[5]黃劍，李天華，崔藝久，等. 放線菌H50發(fā)酵液抑菌活性及其穩(wěn)定性測定[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（3）：311-315.

[6]于銀霞. 168號(hào)放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取和活性研究[D]. 北京：首都師范大學(xué)，2009.

[7]王守彬，王倩，姜曉艷，等. 一株拮抗放線菌的分離鑒定及抑菌活性物質(zhì)的初步研究[J]. 曲阜師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，38（4）：75-79.

[8]馮俊濤，張錦恬，韓立榮，等. 放線菌HJ1-2菌株發(fā)酵液抑菌譜及穩(wěn)定性的研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（6）：280-284.

[9]李璐寧，張薇，趙永強(qiáng)，等. 放線菌Y23菌株發(fā)酵液抗菌活性及穩(wěn)定性測定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：71-74.

[10]楊曉楠，李楊，苗建強(qiáng)，等. 拮抗放線菌T111菌株鑒定、發(fā)酵液理化性質(zhì)測定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2011，17（4）：541-547.楊衛(wèi)民，杜京旗，趙君 . 火焰原子吸收光譜法測定不同產(chǎn)地棗果中的礦質(zhì)元素[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：331-334.