陶宏征等

摘要：為篩選適合工業(yè)發(fā)酵的抗枇杷根腐病病菌中的枇杷主干內(nèi)生真菌菌株，對(duì)抗枇杷根腐病病菌的6株枇杷主干內(nèi)生真菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明：在參試菌株中，DPZG15菌株生長(zhǎng)適應(yīng)性最強(qiáng)，對(duì)pH值、光無(wú)特殊要求，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽糖或蔗糖為碳源、牛肉膏或酵母膏為氮源、25～28 ℃條件下生長(zhǎng)達(dá)到最佳水平。

關(guān)鍵詞：枇杷；內(nèi)生真菌；枇杷根腐??；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S436.67+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0166-03

枇杷（Eriobotrya japonica）為薔薇科常綠喬木果樹(shù)，是我國(guó)亞熱帶地區(qū)的特色水果[1]，含川貝堿、西貝素等多種生物堿[2]。植物內(nèi)生真菌普遍存在于各種植物健康組織內(nèi)或細(xì)胞間隙，不僅能促進(jìn)寄主植物生長(zhǎng)，還可以產(chǎn)生與寄主相同或相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗菌、殺蟲(chóng)等多種生物活性[3-6]。目前，尚未見(jiàn)枇杷內(nèi)生真菌的研究報(bào)道。枇杷根腐病是枇杷生產(chǎn)上發(fā)生嚴(yán)重而普遍的土傳病害之一，其田間癥狀初期表現(xiàn)出樹(shù)勢(shì)衰退，葉片起初變黃，之后變成褐色；葉子在脫落之前緩慢下垂；偶爾下大雨時(shí)，植株發(fā)病較快，只留下褐色干枯的葉片掛在死樹(shù)枝上；莖干顏色呈暗褐色，基部腐爛，韌皮部呈魚鱗狀；地上部維管組織呈紅褐色；后期植株萎蔫、樹(shù)皮脫落，最后整株枯死。臺(tái)灣[7]、福建[8]、云南[9]等省份陸續(xù)報(bào)道有枇杷根腐病發(fā)生，損失率高達(dá)40%以上，且有逐漸加重之勢(shì)，制約著枇杷產(chǎn)業(yè)發(fā)展?；瘜W(xué)防治對(duì)于土傳病害收效甚微，加上化學(xué)農(nóng)藥不符合綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要求，生物防治日趨受到人們的重視。鑒于此，本研究從枇杷主干內(nèi)生真菌中挑選對(duì)枇杷根腐病病菌抑制率高于50%的菌株[10]，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性研究，為其工業(yè)發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1枇杷主干內(nèi)生真菌從蒙自枇杷園區(qū)采集枇杷主干韌皮部，常規(guī)組織分離[11]獲得6株參試菌株，其中菌株DPZG11、DPZG12、DPZG13、DPZG14、DPZG15、DPZG16 均為枝頂孢屬（Acremonium）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：200 g 馬鈴薯、16 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：200 g馬鈴薯、16 g蔗糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）：200 g胡蘿卜、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；玉米瓊脂培養(yǎng)基（MA）：30 g 玉米、17 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；小麥瓊脂培養(yǎng)基（WA）：30 g小麥、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；枇杷瓊脂培養(yǎng)基（LA）：200 g枇杷葉、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；察氏 培養(yǎng)基：2.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸二氫鉀、0.50 g氯化鉀、0.50 g七水硫酸鎂、0.01 g硫酸鐵、30.00 g蔗糖、20.00 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水。所用試劑均為分析純。

1.1.3試劑碳源為可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、葡萄糖、甘露醇；氮源為酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨；均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1測(cè)定不同培養(yǎng)基對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響將枇杷主干內(nèi)生真菌在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng) 7 d[11]，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，同時(shí)接種于PDA、PSA、CA、MA、WA、LA 6種培養(yǎng)基平板中央，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法[11]測(cè)定各菌株菌落直徑。

1.2.2測(cè)定碳、氮源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳源（可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、葡萄糖、甘露醇）和氮源（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨）替換蔗糖和硝酸鈉，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

1.2.3測(cè)定不同pH值對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響以PDA為供試培養(yǎng)基，用0.1%鹽酸、0.1%氫氧化鈉將pH值調(diào)至4、5、6、7、8、9、10，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

1.2.4測(cè)定不同溫度對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒溫培養(yǎng)，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

1.2.5測(cè)定不同光處理對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光暗交替（12 h光照、12 h黑暗）、全黑暗、全光照3種光處理下培養(yǎng)，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)相關(guān)步驟[11]。

以上所有培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌25 min。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件的Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算處理間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

表1顯示，參試菌株DPZG11在PDA、PSA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著，在WA、LA 2種培養(yǎng)基間差異顯著，在其余2種供試培養(yǎng)基差異極顯著；DPZG12、DPZG13在CA、MA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著，但與其余4種供試培養(yǎng)基差異極顯著；DPZG14在PSA、MA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著；DPZG15在供試的6種培養(yǎng)基間菌落直徑差異極顯著；DPZG16在PSA、CA 2種培養(yǎng)基間菌落直徑差異不顯著，在WA、LA 2種培養(yǎng)基間差異也不顯著，但與其余2種供試培養(yǎng)基差異極顯著。其中，菌株DPZG14、DPZG16 菌絲生長(zhǎng)最適合的培養(yǎng)基為PDA，菌株DPZG12、DPZG13菌絲生長(zhǎng)最適合的培養(yǎng)基為PSA，DPZG15菌絲生長(zhǎng)最適合的培養(yǎng)基為CA，DPZG11菌絲生長(zhǎng)最適合的培養(yǎng)基為PDA或PSA。結(jié)果說(shuō)明，參試菌株?duì)I養(yǎng)適應(yīng)性存在多樣性。

2.2不同碳源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2顯示，參試菌株DPZG11在供試的6種碳源間菌落直徑差異極顯著；DPZG12在葡萄糖、蔗糖2種碳源間菌落直徑差異不顯著，在可溶性淀粉、甘露醇2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與α-乳糖差異極顯著；DPZG13在葡萄糖、α-乳糖2種碳源間菌落直徑差異不顯著，但與其余3種供試碳源差異極顯著；DPZG14在麥芽糖、甘露醇2種碳源中菌落直徑差異不顯著，在葡萄糖、α-乳糖 2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與可溶性淀粉差異極顯著；DPZG15在葡萄糖、可溶性淀粉2種碳源間菌落直徑差異不顯著，在蔗糖、麥芽糖2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與其余2種供試碳源差異極顯著；DPZG16在葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉3種碳源中菌落直徑差異不顯著，所有碳源均與α-乳糖差異極顯著。其中，DPZG11、DPZG13菌株菌絲生長(zhǎng)最適合的碳源為麥芽糖，DPZG14最適合的碳源為可溶性淀粉，DPZG15最適合的碳源為蔗糖或麥芽糖，DPZG16最適合的碳源為蔗糖或甘露醇，DPZG12在不添加碳源的培養(yǎng)基中菌落直徑最大，對(duì)碳源無(wú)依賴性，結(jié)果表明，參試菌株碳源適應(yīng)性同樣存在多樣性。

2.3不同氮源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表3顯示，參試菌株DPZG11在硫酸銨、尿素2種氮源

2.5不同溫度對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5顯示，參試菌株在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。DPZG11菌株菌絲生長(zhǎng)最適合的溫度為25～30 ℃；DPZG12最適合的溫度為25 ℃；DPZG13、DPZG14最適合的溫度為30 ℃；DPZG15最適合的溫度為25～28 ℃；DPZG16最適合的溫度為20 ℃。說(shuō)明各參試菌株的溫度適應(yīng)性也存在差異。

2.6不同光處理對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表6顯示，在光暗交替（12 h光照、12 h黑暗）、全黑暗、全光照3種光處理下，DPZG11、DPZG12、DPZG15菌株菌落直徑均達(dá)90.0 mm，生長(zhǎng)不受光的影響；DPZG13、DPZG14在全光照時(shí)菌落直徑最大；DPZG16菌株全黑暗最適合其菌絲生長(zhǎng)。說(shuō)明參試菌株對(duì)光的適應(yīng)性也存在差異。

3結(jié)論與討論

在6種供試培養(yǎng)基中，PDA、PSA、CA培養(yǎng)基最適合各參試菌株菌絲生長(zhǎng)，此研究結(jié)果與筆者所在課題組報(bào)道的另外6株枇杷內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[12]一致。在供試碳源中，麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇最適合各參試菌株菌絲生長(zhǎng)，此結(jié)果與筆者所在課題組報(bào)道的另外6株枇杷內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[12]不一致。在供試氮源中，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨最適合各參試菌株菌絲生長(zhǎng)，此結(jié)果與筆者所在課題組報(bào)道的其余6株枇杷內(nèi)生真菌[12]、銀杏內(nèi)生真菌[13]的研究結(jié)果一致。20～30 ℃最適合各參試菌株菌絲生長(zhǎng)，此結(jié)果與鹿蹄草屬內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[14]不一致。DPZG12、DPZG15生長(zhǎng)不受pH值及光照限制，其他4個(gè)菌株最適合的pH值及光照各不相同，此研究結(jié)果與筆者所在課題組報(bào)道的另外6株枇杷內(nèi)生真菌的研究結(jié)果[12]不一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，枇杷主干中的各內(nèi)生真菌菌株生長(zhǎng)喜好不盡相同，其中DPZG15菌株生長(zhǎng)適應(yīng)性最強(qiáng)，較其他菌株更具開(kāi)發(fā)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

各參試菌株均為枝頂孢屬真菌，葉利芹等曾研究赭紅枝頂孢（Acremonium salmoneum）培養(yǎng)條件[15]及其竹葉銹病菌的重寄生作用[16]。枝頂孢屬作為殺蟲(chóng)生防制劑的研究也有報(bào)道[17-18]。另外，黎起秦等用針刺接種法和浸根法將內(nèi)生菌B47成功地定殖到番茄體內(nèi)[19]。江木蘭等通過(guò)浸種法把油菜內(nèi)生生防菌BY-2定殖到油菜體內(nèi)[20]。李紅剛等又通過(guò)研磨組織涂抹法把內(nèi)生放線菌定殖植株體內(nèi)[21]。而定殖的生防菌株受到植物組織的良好保護(hù)[22]，這為今后DPZG15定殖到植株體內(nèi)提供了理論支持和經(jīng)驗(yàn)借鑒。

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