苗利娟等

摘要：選用河南省育成的5個不同類型的花生品種，在6種培養(yǎng)基配方及2種光照處理下進行胚小葉外植體誘導體胚效率研究。結(jié)果表明，豫花1號、豫花22號、豫花9719、豫花9847等4個品種體細胞胚誘導率均在2，4-D濃度為15 mg/L時最高，2種光周期處理的趨勢一致，豫花9719的體細胞胚誘導率最高。在4周全黑暗培養(yǎng)條件下，豫花12號體細胞胚誘導率在2，4-D濃度為5 mg/L時最高，而在暗2周轉(zhuǎn)光暗交替（其中光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h）2周處理條件下，2，4-D濃度為10 mg/L時體細胞胚誘導率最高，達45.00%；可見暗培養(yǎng)的平均誘導率低于暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周處理。因此，以育成品種胚小葉為外植體直接誘導體細胞胚，2，4-D濃度以10～15 mg/L為宜，暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周處理的體細胞胚誘導率較高。

關(guān)鍵詞：花生；幼葉；體細胞胚胎；培養(yǎng)基；光周期

中圖分類號： S565.203.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0068-03

收稿日期：2014-05-06

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（編號：2011CB109304）；國家“863”計劃（編號：2013AA102602）；國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（編號：CARS-14）；河南省財政專項（編號：201218305）。

作者簡介：苗利娟（1981—），女，河南滑縣人，碩士，助理研究員，主要從事花生基因工程研究工作。Tel：（0371）65750825；E-mail：miao8139@163.com。

通信作者：張新友，博士，研究員，主要從事花生遺傳育種研究工作。Tel：（0371）65729560；E-mail：haasz@126.com?；ㄉ俏覈匾挠土献魑?，在全國各省（區(qū)、市）均有種植。近年來，河南省花生種植面積位居全國首位，常年種植面積穩(wěn)定在100萬hm2左右。在氣候惡化、災害性天氣頻發(fā)、環(huán)境污染等問題下，為生產(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強的花生優(yōu)良品種、對保障花生生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展和食用油安全具有重要意義。眾所周知，栽培花生遺傳基礎狹窄，缺乏抗病、抗蟲、耐逆性突出的種質(zhì)資源，常規(guī)育種難以在優(yōu)質(zhì)、多抗新品種選育方面取得重大突破；野生種質(zhì)的優(yōu)異基因常與一些不良性狀基因連鎖，且與栽培種之間存在雜交不親和、雜種不育等障礙，難以直接通過雜交方法加以利用?；蚬こ虨榛ㄉ猛庠椿蛱峁┯行緩剑延卸嗬没蚬こ踢M行花生代謝途徑遺傳調(diào)控或?qū)⑼庠椿虺晒D(zhuǎn)入花生，改良花生品質(zhì)、抗病、抗蟲、耐旱、耐鹽等性狀的研究報道[1-9]。然而，基因轉(zhuǎn)化及植株再生效率受基因型影響較大，國內(nèi)外遺傳轉(zhuǎn)化的成功實例基本局限在少數(shù)幾個誘導率較高的基因型上。本研究旨在探索河南省育成花生品種的組培再生效果，擴大花生基因轉(zhuǎn)化的受體基因型范圍，為基因工程技術(shù)與常規(guī)育種的結(jié)合奠定基礎。

1材料與方法

1.1植物基因型

選用不同時期河南省育成審定的5個花生品種：豫花1號、豫花12號、豫花22號、豫花9719、豫花9847，其中豫花1號、豫花9719為大果品種，豫花12號、豫花22號為小果品種，豫花9847為中果品種。

1.2胚小葉外植體制備及培養(yǎng)

選取籽粒飽滿、無破損的花生種子，置于三角瓶中，在超凈工作臺上用75%乙醇浸潤洗30 s，然后用0.1% HgCl2浸泡8～10 min，中間輕搖數(shù)次，用無菌水沖洗3～4次，浸泡3～4 h，用鑷子將種皮去掉，并掰去1張子葉，將帶胚軸子葉接種于MS培養(yǎng)基中，于25 ℃ 下光照培養(yǎng)。取出培養(yǎng)4 d的帶胚軸子葉，在超凈工作臺上從小葉柄以上切取胚小葉，接種于體胚誘導培養(yǎng)基（以MS為基本培養(yǎng)基，附加1、3、5、10、15、20 mg/L 2，4-D，分別記為培養(yǎng)基1、2、3、4、5、6），每個品種接種50個外植體，重復2次，置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，設2個光照處理：全黑暗培養(yǎng)4周、暗2周轉(zhuǎn)光暗交替（其中光照培養(yǎng)16 h、黑暗培養(yǎng)8 h）2周。

1.3統(tǒng)計分析

4周后統(tǒng)計產(chǎn)胚外植體數(shù)，計算體細胞胚誘導率：體細胞胚誘導率=產(chǎn)胚外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1體細胞胚的形成

預培養(yǎng)4 d的胚小葉外植體接種于誘導培養(yǎng)基上，1周后葉片切口處膨大并有少量的黃綠色愈傷組織出現(xiàn)；培養(yǎng)至3周左右，愈傷組織表面出現(xiàn)顆粒狀突起，隨著繼代時間的延長，很快形成簇狀、易剝離的體細胞胚，每個外植體上形成3～5 個體細胞胚，顏色為淡綠色（圖1）。

2.2不同基因型品種體細胞胚誘導率

豫花1號、豫花22號、豫花9719、豫花9847等4個品種的體細胞胚誘導率均在2，4-D濃度為15 mg/L時最高，2種光周期處理的趨勢一致：當2，4-D濃度為0～15 mg/L時，體細胞胚誘導率基本上隨2，4-D濃度的升高而逐漸提高，其中豫花9719的體胚誘導率最高，最高達75.58%；其次為豫花1號；當2，4-D濃度為20 mg/L時，這4個品種體細胞胚誘導率明顯降低（圖2-A至圖2-D）。在全黑暗培養(yǎng)4周的條件下，只有豫花12號體細胞胚誘導率在2，4-D濃度為5 mg/L時最高；在暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周條件下，豫花12號體細胞胚誘導率在2，4-D濃度10 mg/L時最高，達4500%（圖2-E），高于全黑暗培養(yǎng)4周處理的誘導率，不同基因型花生體細胞胚誘導率差異很大，大多數(shù)品種的誘導率在 2，4-D 濃度為10～15 mg/L 時較高，可見2，4-D的適宜濃度為10～15 mg/L。

2.3光周期對體細胞胚再生率的影響

由表1可知，全暗培養(yǎng)4周處理的平均誘導率低于暗2周轉(zhuǎn)光暗交替處理。其中，豫花1號和豫花9847等2個品種體胚誘導率在這2種光周期培養(yǎng)條件下的差異較大，而豫花9719的體胚誘導率在這2種光周期培養(yǎng)條件下差異較小?？梢姡诎?周轉(zhuǎn)光暗交替2周條件下誘導胚狀體可以提高

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，以胚小葉為外植體直接誘導體細胞胚，培養(yǎng)基中2，4-D濃度以10～15 mg/L為宜，光周期以暗2周轉(zhuǎn)光暗交替2周處理的體細胞胚誘導率較高。不同基因型花生體細胞胚誘導率差異很大，豫花9719的體胚誘導率最高，達到75.58%。

3.12，4-D最佳濃度差異

2，4-D是體細胞胚誘導常用的激素，喬利仙等研究了山東省不同類型花生品種的體細胞胚誘導和再生情況，在2，4-D濃度為10 mg/L下獲得較高的體胚誘導率[10]。蔣菁等以花生胚小葉為外植體，在含10 mg/L 2，4-D的誘導培養(yǎng)基上，體胚誘導率最高的達到62.8%[11-12]。周蓉等發(fā)現(xiàn) 10 mg/L 2，4-D有利于提高體胚誘導率[13]。劉艷芝等以花生品種四粒紅的胚軸為外植體，誘導體胚2，4-D最佳濃度為20 mg/L，體細胞胚發(fā)生率達到66.67%。有的研究結(jié)果與本研究的10～15 mg/L為最佳濃度范圍有所不同，這可能由選用不同的基因型和不同外植體對誘導的反應差異所致。

3.2基因型誘導反應差異

Chengalrayan等比較了美國弗吉尼亞型（普通型大花生）與蘭娜型（小花生）的體細胞胚誘導和再生反應，結(jié)果表明，胚性愈傷誘導率、體細胞胚發(fā)生和再生率與基因型相關(guān)，結(jié)果顯示蘭娜型比弗吉尼亞型誘導效應強[15]。喬利仙等認為，在2，4-D濃度為10 mg/L時，珍珠豆型和普通型品種體細胞胚誘導率變異范圍較相近，為42.2%～85.0%，龍生型體細胞胚誘導率61.1%～87.8%，魯花14號、魯花8號、魯花9號、魯花22號等中間型品種體細胞胚誘導率為84.1%～912%[10]。本研究的普通型大花生豫花9719具有較高的體細胞胚誘導率，珍珠豆型花生品種豫花22號體細胞胚誘導率較低，進一步說明不同基因型對體細胞胚誘導反應差異較大。

3.3光周期處理差異

前人利用不同外植體直接誘導體細胞胚發(fā)生，在光周期方面也進行了大量研究，結(jié)果表明黑暗培養(yǎng)的體細胞胚誘導率稍低[11，16-17]，與本研究結(jié)果一致。但進一步的體細胞胚萌發(fā)試驗結(jié)果顯示，黑暗培養(yǎng)的體細胞胚易于再生植株；本研究中黑暗處理對體細胞胚再生的影響有待進一步試驗。

參考文獻：

[1]Livingstone D M，Hampton J L，Phipps P M，et al. Enhancing resistance to Sclerotinia minor in peanut by expressing a barly oxidase gene[J]. Plant Physiology，2005，137：1354-1362.

[2]Bhatnagar-Mathur P，Devi M J，Reddy D S，et al. Stress-inducible expression of At DREB1A in transgenic peanut （Arachis hypogaea L.） increases transpiration efficiency under water-limiting conditions[J]. Plant Cell Reports，2007，26：2071-2082.

[3]Anuradha T S，Divya K，Jami S K，et al. Transgenic tobacco and peanut plants expressing a mustard defensin show resistance to fungal pathogens[J]. Plant Cell Reports，2008，27：1777-1786.

[4]黃冰艷，張新友，苗利娟，等. 花生FAD2基因RNAi載體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因籽粒脂肪酸分析[J]. 中國油料作物學報，2008，30（3）：290-293.

[5]Niu C，Akasaka-Kennedy Y，F(xiàn)austinelli P，et al. Antifungal activity in transgenic peanut （Arachis hypogaea L.） conferred by a nonheme chloroperoxidase gene[J]. Peanut Science，2009，36：126-132.

[6]Sundaresha S，Kumar A M，Rihino S，et al. 2010. Enhanced protection against two major fungal pathogens of groundnut，Cercospora arachidicola and Aspergillus flavus in transgenic groundnut over-expressing a tobacco β1-3 glucanase[J]. European Journal of Plant Pathology，2010，126：497-508.

[7]Asif M A，Zafar Y，Iqbal J，et al. Enhanced expression of AtNHX1，in transgenic groundnut （Arachis hypogaea L.） improves salt and drought tolerance[J]. Molecular Biotechnology，2011，49：250-256.

[8]Tiwari S，Mishra D K，Chandrasekhar K，et al. Expression of δ-endotoxin Cry1EC from an inducible promoter confers insect protection in peanut （Arachis hypogaea L.） plants[J]. Pest Management Science，2011，67：137-145.

[9]Iqbal M M，Nazir F，Ali S，et al. 2012. Over expression of rice chitinase gene in transgenic peanut （Arachis hypogaea L.） improves resistance against leaf spot[J]. Molecular Biotechnology，2012，50：129-136.

[10]喬利仙，隋炯明，譚玲玲，等. 花生體胚誘導及植株再生[J]. 農(nóng)學學報，2012，2（10）：9-13.

[11]蔣菁，熊發(fā)前，唐秀梅，等. 赤霉素、光照及基因型對花生體細胞胚誘導和植株再生的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2013，44（6）：903-908.

[12]蔣菁，唐秀梅，熊發(fā)前，等. 花生體細胞胚誘導及植株再生研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2012，28（3）：138-142.

[13]周蓉，廖伯壽，陳小媚，等.影響花生體細胞胚胎發(fā)生因素的研究[J]. 花生學報，2001， 30（3）：9-12.

[14]劉艷芝，韋正乙，譚化，等. 花生體細胞胚發(fā)生及植株再生[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學，2008，33（4）：7-10.

[15]Chengalrayan K，Gallo-Meagher M. Evaluation of runner and virginia market types for tissue culture responses[J]. Peanut Science，2004，31（2）：74-78.

[16]晏立英，陳坤榮，羅莉霞，等. 花生體細胞胚胎誘導和植株再生研究[J]. 中國油料作物學報，2000，22（3）：9-12.

[17]張書標， 莊偉建. 不同品種、外植體和光照條件對花生體細胞胚誘導的影響[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2001，20（4）：243-245.