高彥華，　羅玉琴，　馬慶苓，　賽德艾合買提·吾拉木，　阿吉艾克拜爾·艾薩*

（1.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆　烏魯木齊　830011；2.省部共建新疆特有藥用資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新疆　烏魯木齊　830011；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京　100049；4.新疆伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)系，新疆　伊寧　835000）

大孔吸附樹脂富集純化鷹嘴豆芽總異黃酮的工藝研究

高彥華1，2，3，羅玉琴1，2，馬慶苓1，2，賽德艾合買提·吾拉木1，4，阿吉艾克拜爾·艾薩1，2*

（1.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830011；2.省部共建新疆特有藥用資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新疆烏魯木齊830011；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；4.新疆伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)系，新疆伊寧835000）

目的 研究大孔吸附樹脂分離純化鷹嘴豆芽總異黃酮的工藝參數(shù)。方法 以鷹嘴豆芽總異黃酮為考察指標(biāo)，對(duì)8種大孔樹脂采用靜態(tài)吸附方法，優(yōu)選出吸附解吸性能最佳的大孔樹脂，并優(yōu)化純化條件，確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果HPD-300型樹脂對(duì)鷹嘴豆芽總異黃酮有較好的吸附和解吸效果。其最佳純化條件為：上樣質(zhì)量濃度3.05 mg/mL，上樣體積4.5 BV，上樣體積流量為2 BV/h；6 BV蒸餾水除雜后，繼用5 BV20%乙醇洗脫除雜；洗脫劑95%乙醇，洗脫用量6 BV，洗脫體積流量2 BV/h。按此工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)，總異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到41.1%。結(jié)論 HPD-300型大孔樹脂適合富集純化鷹嘴豆芽總異黃酮。

鷹嘴豆芽；總異黃酮；大孔吸附樹脂；純化

豆科鷹嘴豆屬Cicer植物全球共發(fā)現(xiàn)有44種，主要分布于亞洲西部和近中東地區(qū)，鷹嘴豆Cicer arietinum L是本屬植物中唯一栽培成功、栽種面積較廣的世界第三大食用豆類［1］。在我國(guó)的西部新疆鷹嘴豆已有2500年的栽培歷史，是新疆維吾爾族民間藥食兼用的植物，收載于《藥品標(biāo)準(zhǔn)》（維吾爾分冊(cè)）和《維吾爾藥志》［2-3］。異黃酮類化合物是鷹嘴豆中報(bào)道較多的有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降低血液膽固醇、降低患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)、改善心血管疾病、以及防治雌激素分泌失調(diào)引起的多種疾病等作用［4-6］。前期研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆發(fā)芽后其豆芽中總異黃酮量能增長(zhǎng)到原籽粒的數(shù)十倍之多；鷹嘴豆芽中異黃酮成分的種類也有很大的變化，其提取物在抗氧化活性方面有顯著的提高［7-9］。大孔樹脂是近年來被廣泛應(yīng)用于天然活性物質(zhì)分離純化的一種高聚物吸附劑，其具有吸附容量大、再生簡(jiǎn)單、使用周期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)［10］。目前，利用大孔樹脂純化黃酮、異黃酮的研究報(bào)道很多［11-12］，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)8種不同型號(hào)的大孔樹脂進(jìn)行了富集純化鷹嘴豆芽總異黃酮的篩選，確定了采用HPD-300型大孔樹脂對(duì)鷹嘴豆芽總異黃酮富集純化的工藝。

1　儀器與材料

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；Waters a11iance e2695高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；XMT-DA電熱恒溫水浴鍋（余姚市亞星儀器儀表有限公司）；恒振HZ系列全自動(dòng)豆芽機(jī)（山東青州恒振豆芽機(jī)械有限公司）；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；ESJ180-4電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）。鷹嘴豆芽素A（批號(hào)111708-200501）、芒柄花素（批號(hào)111703-200602）對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。大孔吸附樹脂：HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-600、HPD-750（滄州寶恩化工有限公司）、D101（上海摩速科學(xué)器材有限公司）、AB-8（南開大學(xué)化工廠）、ADS-7（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）。

鷹嘴豆（卡布里）干燥種子于2012年9月采自新疆木壘縣。鷹嘴豆種子在常溫水中浸泡12 h后放入豆芽機(jī)中。在恒溫、恒濕條件下生長(zhǎng)96 h后摘取豆芽，室溫下干燥。將干燥鷹嘴豆芽粉碎，過40目篩，得鷹嘴豆芽粉末，備用。

2　方法與結(jié)果

2.1吸附原液的制備 稱取鷹嘴豆芽粉末，加20倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h，提取液過濾、減壓濃縮至無醇味，備用。

2.2總異黃酮的測(cè)定

2.2.1線性關(guān)系考察 取60℃干燥至恒定質(zhì)量的鷹嘴豆芽素A對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成14.5μg/m L的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。以甲醇為空白，在260 nm處測(cè)定吸光度（A）值，以A值（Y）對(duì)鷹嘴豆芽素A質(zhì)量濃度（Ⅹ）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.127 44Ⅹ+0.00 40 4，r=0.999 8，表明鷹嘴豆芽素A在1.45～8.7μg/mL的范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2.2方法學(xué)考察 通過精密度（RSD=0.27%），穩(wěn)定性（3 h內(nèi)，RSD=0.69%），重復(fù)性（RSD=0.96%）的考察，表明該方法對(duì)總異黃酮的測(cè)定穩(wěn)定、可行。

2.2.3回收率考察 精密稱取適量的豆芽粉末樣品9份，分別加入一定量的鷹嘴豆芽素A對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)方法制備樣品溶液，之后分別置100 mL量瓶中，用65%的乙醇溶解定容至刻度、搖勻。精密量取溶液2.5 mL至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻后，在260 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品總異黃酮含有量。計(jì)算回收率及RSD值，結(jié)果表明該方法回收率良好，見表1。

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4上柱液中總異黃酮的測(cè)定 取樣品液稀釋到一定質(zhì)量濃度，按“2.2.1”項(xiàng)方法，在260 nm測(cè)定吸光值，計(jì)算樣品液中總異黃酮的質(zhì)量濃度。

2.3大孔吸附樹脂型號(hào)的篩選

2.3.1大孔樹脂的預(yù)處理與含水量的測(cè)定 取8種型號(hào)不同極性的新購(gòu)大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后裝入玻璃色譜柱。用95%乙醇沖洗至流出的乙醇液與蒸餾水混合不出現(xiàn)白色渾濁。用大量的蒸餾水洗去乙醇，備用，各取1 g樹脂采用干燥法測(cè)定含水量。

2.3.2靜態(tài)吸附性能的考察 分別精密稱取處理好的8種大孔吸附樹脂，每份相當(dāng)于相應(yīng)干樹脂1.00 g置于50 mL錐形瓶中，精密加入吸附原液20 mL，震蕩吸附24 h，充分吸附后，過濾，測(cè)定濾液中總異黃酮的量，計(jì)算各種樹脂的比吸附量（Qe）及吸附率（E）。

C0為樣品溶液中總異黃酮質(zhì)量濃度，V0為樣品溶液體積，C1為吸附平衡后溶液中總異黃酮的質(zhì)量濃度，V1為吸附平衡后溶液體積，m為樹脂質(zhì)量（g）。

將吸附飽和的大孔樹脂置50 mL瓶中，加入95%乙醇40 mL，密塞，震蕩24 h，充分解吸后，測(cè)定解吸液中總異黃酮的量，計(jì)算各種樹脂的解吸量及解吸率。

解吸量=解吸液中總異黃酮的質(zhì)量/m

解吸率=解吸液中總異黃酮的質(zhì)量/樹脂中吸附的總異黃酮質(zhì)量

由表2結(jié)果可知，在靜態(tài)吸附飽和狀態(tài)下，ADS-7型樹脂對(duì)鷹嘴豆芽總異黃酮的吸附量較大，HPD-300、HPD-600、HPD-100次之。在靜態(tài)洗脫中，HPD-300型樹脂吸附的總異黃酮洗脫量最大。因此綜合飽和吸附量和洗脫量?jī)身?xiàng)指標(biāo)，選用HPD-300型吸附樹脂富集純化鷹嘴豆豆芽總異黃酮。

2.4HPD-300大孔樹脂對(duì)鷹嘴豆芽總異黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附―洗脫參數(shù)考察

2.4.1上樣液總異黃酮質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的HPD-300樹脂5 g（相當(dāng)于干質(zhì)量），濕法裝柱，共6份。配制不同質(zhì)量濃度的鷹嘴豆芽總異黃酮水溶液，保持上樣液總異黃酮量相同（117.8 mg）。以2 BV/h的體積流量上柱吸附，用6 BV蒸餾水3 BV/h的體積流量除去雜質(zhì)，收集過柱殘液和水洗液，測(cè)定總異黃酮，計(jì)算比吸附量及吸附率，結(jié)果見表3?？芍?dāng)鷹嘴豆芽濃縮液總異黃酮質(zhì)量濃度為3.05 mg/mL時(shí)，HPD-300樹脂對(duì)其吸附能力最好。因此，確定3.05 mg/mL為最佳上樣濃度。比吸附量=（上樣液總異黃酮量-過柱液質(zhì)量濃度×過柱液體積-水洗液質(zhì)量濃度×水洗液體積）/樹脂質(zhì)量

2.4.2上樣體積流量對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的HPD-300樹脂6.2 g（V=33 mL），濕法裝柱。取100 mL上樣液，分別以1、2、3、4 BV/h的體積流量上樣吸附；5 BV/h蒸餾水、3 BV/h的體積流量洗脫除雜，收集過柱殘液和水洗液，測(cè)定其中總異黃酮量，計(jì)算樹脂動(dòng)態(tài)吸附量分別為45.73、44.42、44.11、43.61 mg/g。結(jié)果表明，上樣流量慢時(shí)，樹脂的吸附量較大，但所需用的時(shí)間較長(zhǎng)，為了提高效率，確定最佳上樣流量為2 BV/h。

表3　不同上樣液質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響

2.4.3泄露曲線的繪制 按上述所確定的吸附條件，準(zhǔn)確稱取處理好的HPD-300大孔樹脂6.2 g（V=33mL，徑高比1∶6），濕法裝柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。分段收集流出液，每份10 mL，共收集26份。以測(cè)定鷹嘴豆芽總異黃酮質(zhì)量濃度為考察指標(biāo)，繪制泄露曲線，結(jié)果見圖1。可以看出，當(dāng)上樣體積超過150 mL，即上樣體積達(dá)到4.5 BV后，流出液總異黃酮質(zhì)量濃度為0.608 5 mg/mL，相當(dāng)于上柱液質(zhì)量濃度的1/5，達(dá)到了泄露點(diǎn)質(zhì)量濃度［13］。繼續(xù)增加上樣量，流出液中總異黃酮大量泄漏，為了避免上樣液過多泄漏，確定最大上樣體積為4.5 BV。

圖1　HPD-300樹脂動(dòng)態(tài)吸附曲線

2.4.4洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理的HPD-300樹脂6.2 g，濕法裝柱。按照最佳吸附條件上樣吸附后，先用蒸餾水以2 BV/h的體積流量除雜至流出液為無色，再依次用4 BV一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇上柱洗脫，收集各洗脫液，檢測(cè)其中總異黃酮量，并對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫部位中已知異黃酮進(jìn)行HPLC跟蹤分析。濃縮洗脫液、真空干燥至恒定質(zhì)量，計(jì)算總異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，60%乙醇洗脫部位總異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，通過HPLC分析95%乙醇洗脫樣品中已知2種異黃酮含有量較高。而20%乙醇洗脫部分，總浸膏量較多，總異黃酮含有量較少，因此為了優(yōu)化大孔樹脂純化的效果，提高純化目標(biāo)物的純度，選用蒸餾水除雜后，再用20%的乙醇除雜，收集95%乙醇洗脫部分。

表4　不同洗脫劑對(duì)總異黃酮解吸的影響

2.4.5沖洗雜質(zhì)所用溶媒體積分?jǐn)?shù)的考察 準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理的HPD-300樹脂6.2 g，濕法裝柱，共6份。按照最佳吸附條件上樣吸附后，用蒸餾水（6 BV）洗脫至無色。分別用1、2、3、4、5、6 BV體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇以2 BV/h的體積流量洗脫雜質(zhì)，之后用6 BV 95%乙醇以2 BV/h洗脫，收集洗脫液，檢測(cè)并計(jì)算洗脫液中總異黃酮的量，減壓濃縮干燥，恒定質(zhì)量，計(jì)算總異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，用20%乙醇洗脫可以提高純化物中總異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，超過5 BV后對(duì)總異黃酮影響不明顯，使用過多20%乙醇洗脫會(huì)損耗純化物中總異黃酮的量。因此，綜合考慮，選5 BV的20%乙醇洗脫除雜用量。

表5　不同體積20%乙醇除雜用量考察

2.4.6不同洗脫體積流量對(duì)洗脫曲線及解吸量的影響 準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理的HPD-300樹脂6.2 g，濕法裝柱，共4份。按照最佳吸附條件上樣吸附后，分別用6 BV蒸餾水、5 BV 20%乙醇除雜。之后用95%乙醇，分別以1、2、3、4 BV/h體積流量進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)。每20 mL收集一份，測(cè)定解吸液中總異黃酮的量，繪制洗脫曲線，比較不同洗脫流量對(duì)洗脫曲線及解吸量的影響。由圖2可以看出，以1、2 BV/h體積流量洗脫時(shí)，洗脫曲線峰型集中，無明顯拖尾現(xiàn)象，解吸量差異不大。而以3、4 BV/h體積流量洗脫時(shí)，洗脫峰變矮，洗脫峰向后拖延，解吸量也較1、2 BV/h體積流量洗脫時(shí)低。約6 BV洗脫體積后，洗脫液中總異黃酮含有量已經(jīng)很低。綜合考慮洗脫效果和解吸量，確定2 BV/h流量，6 BV的95%乙醇洗脫較合理。

圖2　HPD-300型樹脂洗脫曲線

2.5最佳工藝穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按最佳實(shí)驗(yàn)條件操作。取質(zhì)量濃度為3.05mg/mL的鷹嘴豆芽提取液150 mL，以2 BV/h體積流量上樣，依次用蒸餾水6 BV、20%乙醇5 BV除雜；再用95%乙醇6 BV洗脫，洗脫液，測(cè)定總異黃酮的量。濃縮干燥、恒定質(zhì)量，并計(jì)算浸膏中總異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算總異黃酮的回收率。平行3份，結(jié)果顯示總異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.1%，回收率71%。可以看出經(jīng)HPD-300樹脂純化后，鷹嘴豆芽總異黃酮的出膏率明顯降低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40%以上。

3　討論

3.1鷹嘴豆是為數(shù)不多的含有如芒柄花素（formononetin）、鷹嘴豆芽素A（biochanin A）、芒柄花苷（ononin）、印度黃檀苷（Sissotrin）等幾種特殊異黃酮的日常食用的豆類［14-15］。鷹嘴豆通過發(fā)芽自然生長(zhǎng)的過程是一種富集總異黃酮的方法，也有文獻(xiàn)報(bào)道使用大孔吸附樹脂來分離純化發(fā)芽后的鷹嘴豆中總異黃酮，但因?yàn)辁椬於苟拱曛械挠椭煞趾辛枯^高，提取濃縮液的水溶性較差，導(dǎo)致大孔吸附樹脂容易堵塞、吸附及洗脫難以進(jìn)行［16］。本實(shí)驗(yàn)是選用鷹嘴豆發(fā)芽后含異黃酮量較高的芽部位進(jìn)行提取，本部位提取濃縮液的水溶性較好，大孔吸附樹脂富集純化總異黃酮時(shí)不會(huì)產(chǎn)生堵柱現(xiàn)象，使大孔樹脂富集純化總異黃酮工藝能順利進(jìn)行、樹脂重復(fù)利用性良好。

3.2本實(shí)驗(yàn)考察8種大孔吸附樹脂對(duì)鷹嘴豆芽總異黃酮進(jìn)行靜態(tài)吸附篩選，結(jié)果表明HPD-300型弱極性樹脂具有較好靜態(tài)吸附及解吸效果。針對(duì)HPD-300型樹脂進(jìn)行了吸附、解吸工藝條件的優(yōu)化，純化工藝為：最佳上樣質(zhì)量濃度為3.05 mg/mL的豆芽提取水溶液，以2 BV/h體積流量上樣，體積4.5 BV；吸附飽和后，依次用6 BV蒸餾水、5 BV20%乙醇洗脫除雜；用95%乙醇6 BV洗脫，收集洗脫液濃縮、干燥，即得經(jīng)HPD-300型大孔樹脂純化的鷹嘴豆芽總異黃酮富集純化部位。鷹嘴豆芽提取液中總異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從6.1%提高到41.1%，洗脫率達(dá)到80%。該工藝穩(wěn)定可行，為大生產(chǎn)提供了科學(xué)參考價(jià)值。

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R284.2

B

1001-1528（2015）01-0216-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.049

2013-10-15

新疆維吾爾自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（201110110）

高彥華（1980—），女，博士生，主要從事天然產(chǎn)物研究。Te1：（0991）3836733，E-mai1：gechoao@126.com

阿吉艾克拜爾·艾薩（1965—），男（維吾爾族），博士，研究員，主要從事民族藥學(xué)研究。Te1：（0991）3835679，E-mai1：haji@ms.xjb.ac.cn

日期：2014-03-28

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20140328.1044.001.htm1