董開(kāi)忠，　傅思武，　楊世英，　米友軍，　蘇 露

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅　蘭州　730030）

鐵棒錘提取物對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌體外抑制作用

董開(kāi)忠，傅思武，楊世英，米友軍，蘇 露

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730030）

目的 探索鐵棒錘提取物對(duì)腸道致病菌的體外抑制作用。方法 應(yīng)用水和醇兩種溶劑并輔助超聲波提取法，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定提取物的抑菌性，并通過(guò)光譜法和倍比稀釋法測(cè)定對(duì)腸道致病菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）以及最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）。結(jié)果 鐵棒錘超聲水提物抑菌圈與超聲波醇提物相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)7種腸道致病菌抑菌性隨藥物濃度的增加差異有顯著性（P＜0.01），且MIC在12.5～20 mg/mL范圍內(nèi)。結(jié)論 鐵棒錘水提取物對(duì)細(xì)菌性腸道致病菌在體外有較好的抑制作用。

藏藥；鐵棒錘；腸道致病菌；抑菌作用

藏藥鐵棒錘Aconitum pendulum Busch屬毛莨科烏頭屬草本植物，主要生長(zhǎng)在高海拔（3 300～4 900 m）地區(qū)。是藏族習(xí)用藥之一，名為榜阿那保，具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕，消腫止痛、活血祛瘀等藥理活性［1］。主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛、跌打瘀痛、黃水病，麻風(fēng)，癲狂，腫瘤等疾病的治療［2］。該植物長(zhǎng)期處于強(qiáng)日照、大溫差、高寒缺氧的特殊環(huán)境造就了特有的次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物往往是新藥開(kāi)發(fā)的潛在先導(dǎo)化合物［3］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鐵棒錘的研究主要是成分分離鑒定，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析其根部的5個(gè)主要生物堿成分為12-表-歐烏頭堿、3-脫氧烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿-8-亞油酸酯和烏頭堿-8-亞油酸酯［4-5］；其中部分生物堿具有殺蟲(chóng)［6］和對(duì)小鼠的毒殺活性［7］；段徑云等用鐵棒錘水提浸膏對(duì)小鼠移植瘤［S180（多形細(xì)胞性肉瘤），H22（肝細(xì)胞瘤）和S37（未分化肉瘤）］有明顯抑制作用［8］。目前對(duì)藏藥的藥理研究報(bào)道較少，尚無(wú)鐵棒錘體外抑菌作用的研究，為了探討藏藥鐵棒錘發(fā)揮藥理作用的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)旨在探索藏藥鐵棒錘抑菌物質(zhì)提取工藝及對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌的抑菌作用，明確鐵棒錘對(duì)消化道感染細(xì)菌的抑菌作用特點(diǎn)，為民族醫(yī)藥藏藥研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌種 金黃色葡萄球菌Staphylococcu aureaus（ATCC25923）、大腸埃希菌Escherichia coli（ATCC25922）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（ATCC6633）、傷寒沙門(mén)氏菌Salmonella typhi（CMCC50071）、宋內(nèi)氏痢疾桿菌Shigella sonnei（ATCC25931）、變形桿菌Proteus（ATCC13315）、產(chǎn)氣桿菌Aerobacter aerogenes（ATCC13049）和糞腸球菌Enterococcus faecalis（ATCC29212），均由本院醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品 實(shí)驗(yàn)用鐵棒錘采自甘肅天祝藏族自治縣烏鞘嶺山脈，經(jīng)天祝藏族自治縣藏醫(yī)藥研究所秦寧恩加研究員鑒定為藏藥鐵棒錘，新鮮帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈進(jìn)行提取。

1.3儀器及試劑 實(shí)驗(yàn)儀器為立式高壓蒸汽滅菌器（YXLS-100S2上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；搖床（ZHWY200B上海智城分析儀器制造有限公司）；數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9272MBE上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DL-4000B冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品）；電子天平（CP124S sartious）；生物安全柜（HFsafe-1200 Hea1 Force）；紫外分光光度計(jì)（1810DSPC北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)20110309-01）及營(yíng)養(yǎng)肉湯（批號(hào)20110215-01）由杭州微生物試劑有限公司提供，無(wú)水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純。

1.4鐵棒錘水提物和醇提物的制備 取新鮮鐵棒錘200 g，剪碎用研缽研磨，并均分4份，1份按料液比1∶10（g/mL）加入適量去離子水，浸泡30 min后，超聲提取1 h，6 000 r/min，離心15 min，取上清采用醇沉淀除去葉綠素、蛋白質(zhì)等，獲得鐵棒錘水提物。另取3份按料液比1∶10（g/m L）加入適量不同比例乙醇（50%、70%和95%），浸泡30 min后，超聲提取1 h，6 000 r/min，離心15 min，即得鐵棒錘醇提物。真空干燥得褐黃色浸膏，用DMSO溶解，終質(zhì)量濃度為500 mg/mL，通過(guò)0.22μm無(wú)菌濾器除菌，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

1.5菌液的制備及濁度測(cè)定 取受試菌接種至平板，37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后，經(jīng)染色鏡檢挑取典型菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h，以無(wú)菌生理鹽水10倍逐次稀釋菌液，并檢測(cè)各濃度菌液對(duì)應(yīng)的OD600值［9］，選擇相當(dāng)于0.5倍麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管菌液濃度作為試驗(yàn)用濃度。

1.6瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同提取物的抑菌效果［10-11］取受試菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌菌液0.2mL加入平皿，無(wú)菌涂布棒均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，用直徑6mm無(wú)菌打孔器規(guī)則打孔，各孔加入100μL（50 mg/mL）藥液，以硫酸阿米卡星（0.04mg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO為陰性對(duì)照，將平皿置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18～24h后觀察并測(cè)定抑菌圈的直徑，分析不同提取物的抑菌效果。

1.7熱穩(wěn)定性測(cè)試 將定容至50mg/mL鐵棒錘水提取物分別在60、80、100、120℃加熱處理30min，未進(jìn)行熱處理的相同質(zhì)量濃度的提取物為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌為受試菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性。

1.8水提物對(duì)腸道致病菌的抑菌作用 應(yīng)用分光光度法選擇OD600值為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，以營(yíng)養(yǎng)肉湯為對(duì)照校準(zhǔn)為零，將7種所測(cè)試腸道菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)16h測(cè)OD600值；同法接菌至營(yíng)養(yǎng)肉湯后分別加入不同質(zhì)量濃度提取物（0.5、1.0、2.0、4mg/mL）培養(yǎng)后測(cè)OD600值。

1.9最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）及最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）的測(cè)定 采用對(duì)倍稀釋法測(cè)定鐵棒錘水提取物對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)氏菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的MIC［12］，依次在試管中加入培養(yǎng)基對(duì)倍稀釋的藥物0.5mL，各管中藥物的終質(zhì)量濃度為0.05～100.00mg/mL，每管中加入菌液0.1mL混勻，置37℃恒溫培養(yǎng)24h，測(cè)定各管OD600值，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)管所含最低藥物質(zhì)量濃度為最小抑菌質(zhì)量濃度。以不加藥物（僅加培養(yǎng)基和菌液）管為細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照管。依據(jù)文獻(xiàn)［13］取0.1mL未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的各管培養(yǎng)物涂布于平板，置37℃恒溫培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以菌落數(shù)小于5的最低藥物質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。

2　結(jié)果

2.1鐵棒錘水提物和醇提物的結(jié)果 經(jīng)兩種溶劑并輔助超聲波提取均獲得褐黃色浸膏，且水的提取率為35%，醇的提取率為52%，醇的提取率明顯高于水，隨著醇體積分?jǐn)?shù)增加浸膏提取率基本相同。

2.2菌液濃度比濁度的測(cè)定 波長(zhǎng)600nm處以分光光度計(jì)測(cè)得相當(dāng)于0.5倍麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木篛D值為0.09，在濃度為1.5×103cfu/mL～1.5×108cfu/mL范圍內(nèi)，隨著菌液濃度的增加，OD600值增加，兩者間存在線性關(guān)系。且經(jīng)反復(fù)測(cè)試所有受試菌在第16小時(shí)均達(dá)到最大菌濃度，此時(shí)測(cè)量的光密度均為最大值。

2.3兩種溶劑提取物的抑菌效果分析 分別以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌為受試菌，應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)試提取物抑菌作用，結(jié)果顯示水提物對(duì)3種受試菌的抑菌圈明顯大于醇提物，而醇提取物抑菌圈大小隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高越來(lái)越小。3種受試菌分別為G+、G-和芽孢菌，依據(jù)抑菌結(jié)果分析水提物可能具有廣譜抑菌性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　鐵棒錘水、醇提取物的抑菌效果比較（±s，n=9）

表1　鐵棒錘水、醇提取物的抑菌效果比較（±s，n=9）

注：與陰性對(duì)照組比較，**P＜0.01

不同提取物抑菌圈直徑/mm枯草芽孢桿菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌陰性對(duì)照組000陽(yáng)性對(duì)照組18±0.2326±0.4222±0.31水提物15±0.57**22±1.34**18±1.19**50%醇提物10±0.63**14±0.48**11±0.59**70%醇提物8±0.349±0.369±0.63 95%醇提物7±0.438±0.217±0.24

2.4熱穩(wěn)定性測(cè)定分析 水提取物經(jīng)不同溫度加熱處理后，進(jìn)行抑菌作用測(cè)定，兩種受試菌抑菌圈大小與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可初步表明溫度對(duì)鐵棒錘抑菌活性沒(méi)有影響，熱穩(wěn)定性好，具有很好的耐熱性。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　鐵棒錘水提取物熱穩(wěn)定性測(cè)試（±s，n=9）

表2　鐵棒錘水提取物熱穩(wěn)定性測(cè)試（±s，n=9）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＞0.05

溫度抑菌圈直徑/mm大腸埃希菌金黃色葡萄球菌陰性對(duì)照組22±1.3418±1.19 60℃22±0.68*18±0.63*80℃22±0.46*18±0.56*100℃22±0.52*18±0.38*120℃22±0.39*18±0.43*

2.5鐵棒錘提取物對(duì)7種細(xì)菌的抑制作用 應(yīng)用分光光度法測(cè)不同質(zhì)量濃度水提取物對(duì)7種常見(jiàn)腸道致病菌的OD600值，結(jié)果與對(duì)照組比較質(zhì)量濃度為0.5、1.0mg/mL的P＜0.05，2.0、4.0mg/mL的P＜0.01，且隨藥物質(zhì)量濃度增加7種受試菌的OD值均不同程度減小，說(shuō)明藥物對(duì)7種受試菌的增殖有明顯的抑制作用，同時(shí)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌都有抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6受試菌對(duì)鐵棒錘提取物MIC及MBC的測(cè)定結(jié)果 置37℃恒溫培養(yǎng)24h，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)管所含最低藥物質(zhì)量濃度即為MIC，依據(jù)文獻(xiàn)［13］以菌落數(shù)小于5的最低藥物質(zhì)量濃度為MBC，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

3　討論

隨著臨床抗感染性疾病抗生素劑量的增加，細(xì)菌耐藥性不斷增加，耐藥成為全球性公共健康問(wèn)題［14］，于是探尋并開(kāi)發(fā)有效的抗菌藥物目前成為國(guó)內(nèi)外抗感染研究的趨勢(shì)和熱點(diǎn)［15］。藏醫(yī)藥學(xué)是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)中的瑰寶，具有悠久的歷史和豐富的蘊(yùn)藏，它是當(dāng)今世界上獨(dú)具特色的民族醫(yī)藥學(xué)體系。取材于高原地區(qū)的植物藥材長(zhǎng)期生存于高海拔、強(qiáng)日照、大溫差、高寒缺氧的高原地理環(huán)境，孕育了多種特有的次生代謝產(chǎn)物，這將是新藥開(kāi)發(fā)的潛在先導(dǎo)化合物，是抗菌藥物研究和開(kāi)發(fā)的新生方向，具有廣闊的應(yīng)用前景。

表3　不同質(zhì)量濃度鐵棒錘水提取物對(duì)腸道病原菌的抑制作用（±s，n=9）

表3　不同質(zhì)量濃度鐵棒錘水提取物對(duì)腸道病原菌的抑制作用（±s，n=9）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

菌株OD600值陰性對(duì)照組提取物質(zhì)量濃度/（mg·mL-1）0.51.02.04.0宋內(nèi)氏痢疾桿菌1.079±0.0150.939±0.021*0.685±0.023*0.425±0.016**0.276±0.018**傷寒沙門(mén)氏菌1.034±0.0180.882±0.022*0.607±0.024*0.490±0.019**0.202±0.024**產(chǎn)氣桿菌1.294±0.0211.057±0.017*0.736±0.026*0.490±0.018**0.198±0.017**大腸埃希菌1.341±0.0230.925±0.021*0.622±0.013*0.384±0.021**0.135±0.019**糞腸球菌0.990±0.0170.705±0.022*0.623±0.019*0.439±0.015**0.236±0.023**變形桿菌1.714±0.0211.199±0.019*0.997±0.018*0.738±0.023**0.423±0.018**金黃色葡萄球菌1.533±0.0190.879±0.023*0.612±0.029*0.436±0.025**0.278±0.021**

表4　鐵棒錘水提物MIC測(cè)定（n=9）

表5　鐵棒錘水提物MBC測(cè)定（n=9）

有關(guān)鐵棒錘活性物質(zhì)提取的方法目前文獻(xiàn)資料顯示為傳統(tǒng)煎煮法和乙醇浸漬法萃取，而本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用水和不同比例的乙醇做為溶劑并借助超聲波萃取，結(jié)果顯示超聲波水提抗菌物質(zhì)效果明顯優(yōu)于超聲波醇提，而超聲波醇提取隨著醇體積分?jǐn)?shù)的增加提取效果越來(lái)越差，這說(shuō)明抗菌有效成分為水溶性。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)超聲波水提法是一種操作簡(jiǎn)單、萃取工藝成本低、綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著的方法。

本實(shí)驗(yàn)首次從其清熱解毒的藥理作用方面對(duì)藏藥鐵棒錘進(jìn)行體外抑制常見(jiàn)腸道致病菌活性研究，結(jié)果表明鐵棒錘顯著抑制大腸埃希菌、變形桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、產(chǎn)氣桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的增殖，這表明鐵棒錘具有廣譜抗菌作用。且對(duì)以大腸埃希菌、變形桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、產(chǎn)氣桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌為代表的G-的抑制效應(yīng)比以金黃色葡萄球菌和糞腸球菌為代表的G+顯著，并在質(zhì)量濃度與抑菌效應(yīng)呈正相關(guān)，此差異性與G+和G-菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成不同有關(guān)［16］。應(yīng)用超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽壓下，溫度達(dá)到121.3℃處理30min仍具有較好的抑菌性，說(shuō)明該抗菌成分熱穩(wěn)定性好，此特性明顯優(yōu)于目前臨床常用的來(lái)源于細(xì)菌、真菌和放線菌的抗菌藥物，可以通過(guò)高壓蒸汽滅菌處理后包裝。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0213-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.048

2014-05-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（ZYZ2012092）

董開(kāi)忠（1971—），男（藏族），博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物應(yīng)用和病原微生物研究。Te1：（0931）2938150，E-mai1：dkz@xbmu.edu.cn