賁 瑩，　張鳳華，　梁文杰，　張 冬，　方 倩

（河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北　石家莊　050200）

不同黃芪劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病大鼠周?chē)窠?jīng)功能及氧化應(yīng)激的作用

賁 瑩，張鳳華，梁文杰，張 冬，方 倩

（河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北石家莊050200）

目的 探討不同黃芪劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠周?chē)窠?jīng)功能及氧化應(yīng)激的作用。方法 用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立SD大鼠糖尿病周?chē)窠?jīng)病變模型，并隨機(jī)分為模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組和α-硫辛酸組。黃芪60 g組和黃芪120 g組分別用含對(duì)應(yīng)量黃芪的補(bǔ)陽(yáng)還五湯濃煎劑灌胃，α-硫辛酸組用20 mg/（kg·d）α-硫辛酸灌胃。另設(shè)正常組。給藥12周后，檢測(cè)空腹血糖（FBG）、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，血中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）水平以及坐骨神經(jīng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性。結(jié)果 與正常組相比，模型組的FBG、MDA水平和caspase-3活性明顯升高，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，黃芪120 g組和α-硫辛酸組MDA水平和caspase-3活性明顯下降，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；黃芪60 g組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT的活力明顯上升，MDA水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。與黃芪60 g組比較，黃芪120 g組SOD活性顯著提高（P＜0.01）；神經(jīng)傳導(dǎo)速度、CAT、GSH-Px活性有增高趨勢(shì)，MDA水平及caspase-3活性有減低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃芪120 g組與α-硫辛酸組比較各指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯能有效減低糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮其保護(hù)作用。120 g黃芪用量的補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗氧化作用略佳。

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變；氧化應(yīng)激；補(bǔ)陽(yáng)還五湯；黃芪

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變是常見(jiàn)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率高達(dá)90%［1］，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但大量研究表明氧化應(yīng)激可以直接或間接地?fù)p傷神經(jīng)細(xì)胞，在糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的發(fā)生中起到了重要作用［2-3］。中醫(yī)認(rèn)為本病主要為絡(luò)氣虛滯，淤血阻絡(luò)［4］，臨床治法上我們應(yīng)用補(bǔ)氣活血通絡(luò)的補(bǔ)陽(yáng)還五湯加減治療取得了較好的療效。但對(duì)其能否通過(guò)改善氧化應(yīng)激而減少周?chē)窠?jīng)損傷，還缺少客觀(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究旨在觀(guān)察不同黃芪劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠氧化應(yīng)激及周?chē)窠?jīng)功能的作用，以期明確補(bǔ)陽(yáng)還五湯方發(fā)揮治療作用的途徑、效果及方中黃芪的最佳劑量，以指導(dǎo)臨床用藥及科研。

1　材料

1.1動(dòng)物 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g（2月齡左右），購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，單位許可證號(hào)SYXK（冀2008-0026）；動(dòng)物合格證號(hào)1301053。

1.2藥物 補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方來(lái)源《醫(yī)林改錯(cuò)》，黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，簡(jiǎn)稱(chēng)黃芪120 g組。另設(shè)黃芪60 g，其余藥物劑量不變，簡(jiǎn)稱(chēng)為黃芪60 g組。以上兩組藥物分別加水浸泡2 h，水煎2次，每次40 min，先后兩次藥液合并、濃縮，分別制成含生藥2.4、1.36 g/mL的藥液。α-硫辛酸購(gòu)于Puritan's Pride公司（100 mg×60粒，批號(hào)：250597-09 EXP 10/12）。

1.3試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)于Sigma公司；微量丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（g1utathion peroxidase；g1utathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；大鼠半胱天冬酶3（caspase-3）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒構(gòu)于BG公司

1.4儀器 One touchII型血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；DANTEC Cantata肌電圖誘發(fā)電位儀；島津紫外分光光度計(jì)UV-1700，pharmaSpec SHIMADIU。

2　方法

2.1分組、建立動(dòng)物模型 60只SD大鼠按體質(zhì)量相似隨機(jī)分為5組，正常組、模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、α-硫辛酸組，每組10只。在禁食12 h后模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、α-硫辛酸組大鼠予一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后大鼠禁食8 h測(cè)鼠尾靜脈血，血糖≥16.7 mmo1/L確立為糖尿病大鼠模型，正常對(duì)照組大鼠注射等量的檸檬酸緩沖液。

2.2給藥 造模成功立即開(kāi)始灌胃，黃芪60 g組、黃芪120 g組按10 mL/（kg·d）分別用相應(yīng)黃芪量藥液灌胃；α-硫辛酸組按20 mg/（kg·d）用α-硫辛酸灌胃；正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間自由飲食，連續(xù)給藥12周。

2.3觀(guān)察指標(biāo)

2.3.1坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定 給藥結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠，用肌電圖儀檢測(cè)大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度［5］。以坐骨窩為第一刺激部位，踝部為第二刺激部位。均經(jīng)皮插入2個(gè)針電極，間距為2 mm，尾部接地，保持皮溫30℃。（1）運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MCV）：方形波刺激神經(jīng)，用2個(gè)針電極于同側(cè)足部骨間肌，記錄復(fù)合肌肉動(dòng)作電位及潛伏期。檢測(cè)3對(duì)不同M波的潛伏期，取平均值。兩個(gè)刺激部位間的傳導(dǎo)時(shí)間為近端、遠(yuǎn)端潛伏期差，測(cè)量?jī)蓚€(gè)刺激部位間的距離。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s）=距離/潛伏期差值。（2）感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SCV）：方形波記錄6對(duì)在坐骨窩和踝激發(fā)的H反射潛伏期，測(cè)量?jī)蓚€(gè)刺激部位間的距離。感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s）=距離/潛伏期差值。

2.3.2血液指標(biāo)測(cè)定 每月1次尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定空腹血糖（FBG）；給藥結(jié)束取血，比色法測(cè)定SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA水平。

2.3.3坐骨神經(jīng)caspase-3活性檢測(cè) 給藥結(jié)束后，腹腔注射烏拉坦麻醉大鼠，分離雙側(cè)坐骨神經(jīng)，迅速取下，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液洗去雜質(zhì)和血漬，濾紙吸干，在-196℃液氮中保存。按試劑盒說(shuō)明用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定Caspase-3活性。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析和SNK法兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠空腹血糖及坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（±s，n=10）

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠空腹血糖及坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（±s，n=10）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空腹血糖/（mmo1·L-1）4周8周12周MCV/（m·s-1）SCV/（m·s-1）正常組4.96±0.63△△5.02±0.58△△4.87±0.51△△45.26±4.35△△46.45±7.12△△模型組26.54±3.77 25.83±4.14 26.10±3.81 30.17±5.16 29.21±9.38黃芪60 g組27.21±3.26 26.36±3.52 25.97±2.72 35.82±6.36△37.06±6.74△黃芪120 g組26.25±3.89 25.74±3.16 24.16±3.05 37.32±6.22△40.17±5.22△△α-硫辛酸組26.12±4.02 26.27±3.35 26.14±3.44 36.79±7.08△39.55±6.38△

3　結(jié)果

3.1空腹血糖變化 模型組、黃芪120 g組、黃芪60 g組、α-硫辛酸組FBG顯著高于正常組。黃芪120 g組FBG略低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3.2各組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較 與正常組比較，模型組坐骨神經(jīng)MCV和SCV明顯減慢（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪60 g組、黃芪120 g組和α-硫辛酸組MCV和SCV明顯提高（P＜0.05），其中黃芪120 g組SCV增高更明顯（P＜0.01）；三藥物干預(yù)組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

3.3各組氧化指標(biāo)及caspase-3活性的變化 模型組比正常組SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯下降（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪60 g組MDA水平降低（P＜0.05），SOD活性上升（P＜0.01）CAT水平升高（P＜0.05）；黃芪120 g組及α-硫辛酸組SOD、GSH-Px、CAT活性均上升（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性顯著降低（P＜0.01）。三藥物干預(yù)組間比較黃芪120 g組與α-硫辛酸組SOD活性較黃芪60 g組升高（P＜0.01），其余指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠血液SOD、GSH-Px、CAT活性、MDA及坐骨神經(jīng)caspase-3活性比較

4　討論

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，一般認(rèn)為與多元醇通路、己糖胺途徑、蛋白激酶C途徑的激活和糖基化終產(chǎn)物的形成、微血管病變、氧化應(yīng)激反應(yīng)等諸多因素有關(guān)［6-7］。其中氧化應(yīng)激在周?chē)窠?jīng)病變中的作用受到了越來(lái)越多的重視。Brown1een［8］提出的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說(shuō)認(rèn)為，經(jīng)典的糖尿病并發(fā)癥的多元醇途徑、糖基化終產(chǎn)物（AGES）途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑和氨基已糖途徑均是高糖條件下線(xiàn)粒體呼吸鏈中氧自由基生成過(guò)多導(dǎo)致的結(jié)果。氧化應(yīng)激在糖尿病并發(fā)癥發(fā)生中處于核心的角色。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitro-gen species，RNS）產(chǎn)生過(guò)多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。糖尿病高血糖狀態(tài)導(dǎo)致ROS和RNS生成增多，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加［9］。一方面，氧自由基可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物。神經(jīng)髓鞘中含有大量脂類(lèi)，體外試驗(yàn)表明在坐骨神經(jīng)組織勻漿中加入20 mmo1/L葡萄糖，使脂質(zhì)過(guò)氧化物增加超過(guò)4倍［10］。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的最終產(chǎn)物為MDA。脂質(zhì)過(guò)氧化作用可放大ROS的作用，交聯(lián)核酸、蛋白質(zhì)及磷脂，也可使蛋白質(zhì)巰基氧化，引起神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步損傷［11］。另一方面，氧化應(yīng)激反應(yīng)可直接引發(fā)單鏈DNA的斷裂，或通過(guò)JNK、P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞中一系列半胱天冬酶激活，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12-13］。其中caspase-3在死亡受體和線(xiàn)粒體介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑中均起著核心作用。由此可見(jiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病周?chē)窠?jīng)病變發(fā)病的重要機(jī)制，目前臨床應(yīng)用抗氧化劑α-硫辛酸治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變，取得了較好療效［14-15］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯有與α-硫辛酸近似的作用，可使糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度增高，提升體內(nèi)抗氧化劑SOD、GSH-Px、CAT活性，而使MDA水平及caspase-3活性明顯下降，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能有效減低糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮其保護(hù)作用。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯為清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，配伍用量特點(diǎn)為君藥黃芪劑量是其他活血通絡(luò)藥總和的5倍，《醫(yī)林改錯(cuò)》中寫(xiě)到“黃芪用一二兩，以后漸加至四兩”，重用黃芪旨在令氣旺血行而瘀去絡(luò)通。為進(jìn)一步探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯配伍中重用黃芪的科學(xué)內(nèi)涵，確定黃芪的最佳劑量，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)置了黃芪60 g組和黃芪120 g組進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示黃芪60 g組與模型組比較神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT活性均顯著增高，MDA水平顯著下降。黃芪120 g組與模型組比較除上述指標(biāo)有如上變化外，GSH-Px活性顯著增高，caspase-3活性明顯下降。但不同黃芪劑量組間比較，除黃芪120 g組SOD活性較60 g組顯著提高外，神經(jīng)傳導(dǎo)速度、GSH-Px、CAT活性有增高趨勢(shì)，MDA水平及caspase-3活性有減低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明使用60 g黃芪的補(bǔ)陽(yáng)還五湯就已經(jīng)顯示了較強(qiáng)的抗氧化作用，增大黃芪劑量可使其抗氧化效果略有增強(qiáng)，臨床治療時(shí)推薦按王清任原方120 g黃芪用量使用。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0199-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.043

2013-11-01

河北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目（QN2014019）

賁 瑩（1979—），女，碩士，講師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)。Te1：13315989821，E-mai1：benyfortunate@sohu.com