劉亞娟，　吳江林，　王詩(shī)豪，　張 銘，　華允芬

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江　杭州　310012；2.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江　杭州　310020；3.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江　杭州　310058）

鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

劉亞娟1，3，吳江林2，王詩(shī)豪3，張 銘3，華允芬1*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310012；2.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江杭州310020；3.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

目的 研究鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法 采用水提醇沉法對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行初步提取，體外培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，通過(guò)克隆形成率試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)及實(shí)時(shí)定量PCR的方法研究鐵皮石斛提取多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖及多能性維持的作用。結(jié)果 鐵皮石斛多糖處理組細(xì)胞（50～200μg/m L）的克隆形成率、MTT吸光度值均高于空白對(duì)照組，同時(shí)其干性相關(guān)基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。結(jié)論 鐵皮石斛多糖可以顯著促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖、提高其克隆形成率，同時(shí)又不影響其多潛能性的維持。

鐵皮石斛；多糖；小鼠胚胎干細(xì)胞；增殖

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo.系蘭科石斛屬多年生草本植物，別名“黑節(jié)草”，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，因其滋陰清熱、益胃生津等功效而享有“民間仙草、植物黃金”的美譽(yù)［1］。自1932年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)石斛屬多種植物進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離鑒定出生物堿類、多糖類、倍半萜類、菲醌類、聯(lián)芐類、芴酮類、甾體類、酚類及揮發(fā)油等多種活性成分［2-3］。胚胎干細(xì)胞是人體及其各種組織細(xì)胞的最初來(lái)源，具有高度自我復(fù)制、高度增殖和多向分化的潛能［4］。胚胎干細(xì)胞研究正在向現(xiàn)代生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域交叉滲透，具有廣泛的應(yīng)用前景，如：用于組織移植、器官修復(fù)［5］；細(xì)胞治療、基因治療［6］及藥物篩選和開(kāi)發(fā)［7］等。目前對(duì)植物多糖的生物活性和功能已有較多研究，如免疫調(diào)節(jié)［8-9］、抗氧化［10］、抗衰老［11］、抗癌［12-13］、抗菌［14］、降血糖［15］等，但鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的作用藥效在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)其相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)的探索研究。

1　材料

1.1儀器 PRISM?7900HT熒光定量PCR儀（ABI公司）；SynergyTMH1全能酶標(biāo)儀（Bio Tek公司）；核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司）；ECLIPSETS100倒置相差顯微鏡（Nikon公司）；YJ-1450醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州金燕凈化設(shè)備廠公司）；HIMAC高速離心機(jī)（Hitachi公司）；冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50，Bi1on公司）；Cryo 1℃程序細(xì)胞凍存盒（Na1gene Labware公司）。

1.2細(xì)胞株 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryo fibrob1asts，MEF）取自妊娠13.5 d的ICR小鼠，所用小鼠購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；小鼠胚胎干細(xì)胞（Mouse embryonic stem ce11s，MES）細(xì)胞系D3由中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所惠贈(zèng)。

1.3試藥 鐵皮石斛全草購(gòu)于浙江臺(tái)州鐵皮石斛種植基地，經(jīng)浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張銘教授鑒定為鐵皮石斛Dendrobium officinale。

噻唑藍(lán)（MTT）、絲裂霉素C、二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸二鈉鈣（EDTA）、明膠、堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物公司；胰蛋白酶購(gòu)于Hyc1one公司，Trizo1購(gòu)于Invitrogen公司；REVER Tra Ace?qPCR RT Kit和THUNDERBIRD SYBR? qPCR Mix購(gòu)于TOYOBO公司。

2　方法

2.1鐵皮石斛多糖的提取 取新鮮的鐵皮石斛全草適量，清水洗滌除去雜質(zhì)，100℃殺青后于60℃烘箱中烘干、粉碎，過(guò)60目篩，取其干燥粉末。用傳統(tǒng)水提醇沉法［16］提取鐵皮石斛粗多糖。所提粗多糖用Sevage法脫蛋白：加入1/5倍體積三氯甲烷-正丁醇（4∶1）混合液劇烈振搖20～30 min，3 000 r/min離心5 min，分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)4～5次；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮、醇析、冷凍干燥得鐵皮石斛多糖。

2.2鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形成率的影響 絲裂霉素C處理后的MEF按5.0×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板中作為飼養(yǎng)層；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的D3細(xì)胞，用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度種到飼養(yǎng)層上，加入終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、25、50、100、200、400μg/mL的鐵皮石斛多糖完全培養(yǎng)液，每個(gè)質(zhì)量濃度做4個(gè)重復(fù)，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)3～4 d后用堿性磷酸酶試劑盒按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行ALP染色，在相差顯微鏡下觀察D3細(xì)胞克隆染色情況并計(jì)數(shù)分析。

2.3鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的D3細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以4.0×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到0.5%明膠包被的96孔板中。培養(yǎng)24 h后更換成含鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、25、50、100、200、400 μg/mL的完全培養(yǎng)液，每個(gè)多糖質(zhì)量濃度做4個(gè)重復(fù)，并做只加培養(yǎng)液的空白孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后的細(xì)胞按已報(bào)道方法［17］進(jìn)行MTT染色，在490 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值。以各個(gè)樣品組的吸光度值減去空白對(duì)照孔的吸光度值作為各組真實(shí)的吸光度值以反映細(xì)胞的增殖水平。

2.4鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞多潛能性的影響 絲裂霉素C處理后的MEF按4.0×105個(gè)/孔的密度接種到6孔板中作為飼養(yǎng)層；按2.0× 104個(gè)/孔的細(xì)胞量接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的D3細(xì)胞到飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)24 h后換成含鐵皮石斛多糖的培養(yǎng)液（終質(zhì)量濃度分別為0、50、100、200、400 μg/mL）。每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)重復(fù)，每天換液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，用Trizo1提取RNA后用REVER Tra Ace?qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后以β-actin為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)小鼠胚胎干細(xì)胞干性相關(guān)基因Nanog、Oct4、Sox2、K1f4、Lin28、Rex1和Aire［18］的相對(duì)表達(dá)量。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各變量均以實(shí)驗(yàn)組±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行繪圖分析。

3　結(jié)果

3.1鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形成率的影響 克隆形成率試驗(yàn)結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖的質(zhì)量濃度在50～200μg/mL時(shí)可以提高小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形成率，并且當(dāng)質(zhì)量濃度為100μg/mL時(shí)作用最為顯著，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛多糖對(duì)m ES克隆形成率的影響（±s，n=3）Tab.1 CIonogenic assay ofm ES ceIIs treated w ith poIysaccharides from Dendrobium officinale（±s，n=3）

表1　不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛多糖對(duì)m ES克隆形成率的影響（±s，n=3）Tab.1 CIonogenic assay ofm ES ceIIs treated w ith poIysaccharides from Dendrobium officinale（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）克隆數(shù)/個(gè)增長(zhǎng)率/% 0 310±6.56—25 315±6.03 0.93 50 353±8.74**7.6 100 378±8.62**13.67 200 327±6.66*3.33 400 305±6.24-0.93

3.2鐵皮石斛多糖對(duì)mES增殖的影響 不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖對(duì)mES作用不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度在50～200 μg/mL時(shí)，作用24、48和72 h對(duì)mES的增殖均有顯著的促進(jìn)作用，如圖1；同一作用時(shí)間時(shí)，曲線均在鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度為100μg/mL時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，說(shuō)明質(zhì)量濃度為100μg/mL時(shí)促進(jìn)作用最為顯著，為促進(jìn)mES增殖的最適宜濃度。

圖1　不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛多糖對(duì)m ES增殖的影響（±s，n=4）Fig.1　Effect of poIysaccharides from Dendrobium officinale on proIiferation ofmES ceIIs（±s，n=4）

3.3鐵皮石斛多糖對(duì)mES多潛能性的影響 qRTPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（50～400 μg/mL）鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞D3干性相關(guān)基因Oct4、Aire、Lin28的表達(dá)量無(wú)顯著影響；50μg/mL的質(zhì)量濃度可以提高Nanog、Sox2、K1f4的表達(dá)量，100μg/mL有利于Nanog、Rex表達(dá)量的提高，如圖2。這些結(jié)果說(shuō)明鐵皮石斛多糖在促進(jìn)mES的增殖的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（50～200 μg/mL）并不影響其干性相關(guān)基因的表達(dá)，甚至有些質(zhì)量濃度（如50，100μg/mL）還可以促進(jìn)某些干性基因（如Nanog，Sox2，K1f4和Rex）的上調(diào)，因此鐵皮石斛多糖在一定程度上有利于mES的自我更新及多潛能性的維持。

4　討論

近年來(lái)，天然多糖的研究逐漸受到人們重視，多糖類作為一類信息物質(zhì)參與機(jī)體分子和細(xì)胞識(shí)別，在受精、發(fā)生、發(fā)育、分化、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方面起著重要作用［19］。石斛多糖是天然多糖中重要的一員，是鐵皮石斛中重要的活性成分，關(guān)于石斛多糖的研究亦已有不少報(bào)道［8-12，14］，然而對(duì)其細(xì)胞藥效學(xué)的研究較少，本實(shí)驗(yàn)研究了鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的影響。胚胎干細(xì)胞具有自我更新的特性及分化為機(jī)體三個(gè)胚層來(lái)源的所有約220種成體細(xì)胞類型的潛能［20］，是研究早期胚胎發(fā)生、細(xì)胞組織分化、基因表達(dá)調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)事件的一個(gè)理想模型，更重要的是人ES細(xì)胞可為臨床上細(xì)胞移植、組織替代和器官克隆提供新的細(xì)胞來(lái)源［5-6］，為多種難治性疾病的治療帶來(lái)希望，具有重要的理論價(jià)值和廣泛的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用前景。

圖2　鐵皮石斛多糖對(duì)m ES干性相關(guān)基因表達(dá)量的影響（±s，n=3）Fig.2　Effect of po Iysaccharides from Dendrobium officinale on the expression of m ES-marker genes（±s，n=3）

本實(shí)驗(yàn)從克隆形成率、增殖速率及多潛能性等方面初步研究了鐵皮石斛多糖對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的作用，對(duì)于更好地理解和調(diào)控胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的行為、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的定向分化、以及了解胚胎發(fā)育過(guò)程的機(jī)制等有重要的意義。然而鐵皮石斛粗多糖作用于小鼠胚胎干細(xì)胞的具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步的探討，此外，對(duì)于人的胚胎干細(xì)胞及其他類型的干細(xì)胞如骨髓干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等是否有不同藥效也需進(jìn)一步的探索研究。

致謝

本實(shí)驗(yàn)在浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張銘教授的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，向趙小立老師及實(shí)驗(yàn)室的所有同學(xué)表示由衷的感謝。

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Effect of poIysaccharides from Dendrobium officinale on mouse embryonic stem ceIIs

LIU Ya-juan1，3， WU Jiang-1in2， WANG Shi-hao3， ZHANG Ming3， HUA Yun-fen1*
（1.Pharmaceutical College，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310012，China；2.Pesticide Verification Management of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China；3.College of Life Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

AIM To study the effect of po1ysaccharides from Dendrobium officinale on mouse embryonic stem ce11s.METHODS Po1ysaccharides from Dendrobium officinale were pre1iminari1y extracted in water and precipi-tated in ethy1a1coho1and purified by removing proteins，then app1ied tomouse embryonic stem ce11s（mES）which were cu1tured in vitro for 24、48 and 72 hours at different concentrations.C1onogenic assay and MTTmethodswere used to determine ce11activity and pro1iferation and qRT-PCRmethod was used to detect the re1evant expression of mES-marker genes.RESULTS The resu1ts showed that the c1oning efficiency and MTT absorbance in po1ysaccharides from Dendrobium officinale（50-200μg/mL）group were higher than that of the contro1 group，meanwhi1e，there was not significant difference in the re1evant expression ofmES-marker genes between the two groups. CONCLUSION Po1ysaccharides from Dendrobium officinale can marked1y promote the pro1iferation and c1oning efficiency ofmES ce11swith unchanged p1uripotency.

Dendrobium officinale；po1ysaccharides；mouse embryonic stem ce11s（mES）；pro1iferation

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0012-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.003

2014-03-12

浙江省自然科學(xué)基金（LQ12C02003）

劉亞娟（1987—），女，碩士生，主要從事研究藥物分析及胚胎干細(xì)胞方向的研究。Te1：15868840442，E-mai1：1iu_yajuan @126.com

華允芬，男，副教授，主要從事天然活性多糖的化學(xué)成分及藥理藥效學(xué)研究。Te1：13173696879，E-mai1：huayfyxwd@ hotmai1.com