史艷利 高嶺 張憲偉 李萌 陳紅兵

羥乙基淀粉沉降法制備外周血富白細(xì)胞血漿的條件優(yōu)化

史艷利 高嶺 張憲偉 李萌 陳紅兵

目的 探討羥乙基淀粉（HES）沉降法制備外周血富白細(xì)胞血漿的最佳分離條件。方法 觀察外周血與 6 %的羥乙基淀粉混勻后靜止30 min、60 min及離心等不同處理后，計(jì)算其回收率。結(jié)果 6 %HES與外周血體積比為 1∶4時(shí)，白細(xì)胞回收率較高，比例增大至l∶1 及4∶1，回收率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6% HES與外周血體積比為1∶4、1∶1及4∶1時(shí)血小板的回收率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 建立制備外周血富白細(xì)胞血漿的優(yōu)化條件：6 %的HES沉淀外周血 60 min，HES與外周血的比例1∶4時(shí)，外周血白細(xì)胞及血小板的回收率最高。

羥乙基淀粉 富白細(xì)胞血漿 富血小板血漿

羥乙基淀粉（HES）可與紅細(xì)胞膜上的負(fù)電荷結(jié)合，使紅細(xì)胞凹面相貼而使得沉降速度加快，以HES為沉降劑可將紅細(xì)胞沉降分離去除。HES為沉降法目前在臍血分離中被廣泛采用［1］。實(shí)際臨床工作中，部分檢測(cè)項(xiàng)目要求外周血富白細(xì)胞及富血小板血漿，而短時(shí)間的高速離心常使白細(xì)胞下沉，本文探討HES沉降法制備外周血富白細(xì)胞血漿的最佳分離條件，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1外周血來(lái)源 外周血采集自本科室健康工作人員，肝素抗凝。6%HES為中國(guó)大冢制藥有限公司生產(chǎn)，主要化學(xué)成分為130/0.4，為氯化鈉復(fù)方制劑。

1.2沉降實(shí)驗(yàn) 將6 % HES溶液與外周肝素抗凝血按一定體積比混勻，置于 5 m1肝素抗凝管自然靜置沉降，室溫靜置30min、60min及沉降60min后低速離心等不同操作后，比較白細(xì)胞及血小板的回收率?；厥章实挠?jì)算公式為：Recovery=Vu·Cu/（Vu·Cu + Vd·Cd）=（Vu/ Vs）·（Cu/Cs）。下層（Ld）主要為紅細(xì)胞團(tuán)，包含少量白細(xì)胞，大部分白細(xì)胞集中在上層（Lu）段，取Lu段液體，計(jì)白細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，Ld段的液體同樣作計(jì)數(shù)，并由此計(jì)算白細(xì)胞回收率。

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù) 白細(xì)胞計(jì)數(shù)：用白細(xì)胞稀釋液進(jìn)行稀釋（冰醋酸2ml，蒸餾水98 ml，10 g/L亞甲藍(lán)溶液3滴），混勻后過(guò)濾備用。血小板計(jì)數(shù)：用 10 g/L的草酸鈉溶液稀釋后，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果

2.16 %HES溶液與全血不同體積比對(duì)白細(xì)胞回收率的影響 6 %HES與外周血體積比為1∶4時(shí)，白細(xì)胞回收率較高，比例增大到1∶1及 4∶1時(shí)，回收率降低。6 %HES與外周血體積比為 1∶4 時(shí)，沉淀60 min時(shí)，白細(xì)胞回收率最高，沉淀30 min時(shí)白細(xì)胞回收率次之，與沉淀60min比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。見(jiàn)表1。

表l HEs與外周血體積比、沉降間、沉降后離心白細(xì)胞回收率（%）

2.26%HEs溶液與全血體積比對(duì)血小板回收率的影響 相同處理?xiàng)l件下，6%HEs與外周血體積比為1∶4、1∶1及4∶1時(shí)PLT的計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2　HEs與外周血體積比、沉降時(shí)間、沉降后離心的血小板回收率（%）

2.36 %HEs與外周肝素抗凝血1∶4混勻?qū)Π准?xì)胞及血小板回收率的影響 選取30份標(biāo)本，6 %HEs與外周肝素抗凝血1∶4混勻，白細(xì)胞及血小板回收率標(biāo)本直接離心2800r/min離心2min后明顯低于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。沉降60min白細(xì)胞的回收率高于其他各組，有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3　6%HEs與外周肝素抗凝血1∶4混勻，白細(xì)胞及血小板回收率（n=30）

2.4綜合上述結(jié)果以及各表結(jié)果，羥乙基淀粉沉降法制備外周血富白細(xì)胞血漿時(shí)，6 %HES與外周血體積比為1∶4時(shí)，且沉降時(shí)間為60min白細(xì)胞回收率較高。

3　討論

HES沉降法［2］在臍血分離中被廣泛應(yīng)用，本文探討6%HES沉降法制備外周血富白細(xì)胞及富血小板血漿的條件優(yōu)化，6%HEs為中分子羥乙基淀粉聚糖復(fù)合物［3，4］。HES沉降法外周血沉降過(guò)程是利用紅細(xì)胞團(tuán)和白細(xì)胞的沉降速度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。紅細(xì)胞團(tuán)快速沉降而導(dǎo)致其周圍液體的向上運(yùn)動(dòng)，帶動(dòng)了白細(xì)胞的向上運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生了對(duì)流現(xiàn)象［5，6］。本資料中HES溶液與全血體積比增大到1∶1及 4∶1 時(shí)，白細(xì)胞回收率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6%HES與外周血體積比為1∶4，1∶4及4∶1時(shí)血小板的計(jì)數(shù)無(wú)差異。6 %HES與外周血體積比為1∶4時(shí)，且沉降時(shí)間為60min白細(xì)胞回收率較高，與郭繼強(qiáng)［7］報(bào)道結(jié)果一致。

臨床上短時(shí)間低速離心外周血?？梢酝ㄟ^(guò)吸取中下層血漿來(lái)獲取富血小板血漿，而部分檢測(cè)指標(biāo)在白細(xì)胞表面分布更廣，這就需要分離出富白細(xì)胞及富血小板血漿，通過(guò)本方法為臨床上需要用外周血中白細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的指標(biāo)提供一個(gè)簡(jiǎn)單優(yōu)化的方法。

1 王穎超，殷楚云，馮磊，等.三種不同的方法分離臍血造血干細(xì)胞的效果比較 .實(shí)用兒科臨床雜志，2012，27（10）：766～768.

2 馬艷，陳雙，畢曉娟，等.羥乙基淀粉一步與兩步法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞及血小板比較.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（40）：7529～8432.

3 Bourzac C， Smith LC， Vincent P， et al. Isolation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells： a comparison between three protocols. Equine Vet J， 2010，42（6）：519～527.

4 Lapierre V， Pellegrini N， Bardey I，et al. Cord blood volume reduction using an automated system （Sepax） vs. a semi-automated system（Optipress II） and a manual method（hydroxyethyl starch sedimentation）for routine cord blood banking： a comparative study.Cytotherapy， 2007，9（2）：165～169.

5 遲占有，姜華，蔡海波，等.羥乙基淀粉沉降法分離臍血過(guò)程的深入分析及條件優(yōu)化 .中國(guó)輸血雜志，2004，17（2）：71～74.

6 Davis RH，Acrivos A.Sedimentation of noncolloidal particles at low reynold numbers.Ann Rev Fluid Mech，1985，17（1）：91～118.

7 郭繼強(qiáng)，劉愛(ài)兵，沈丹.兩步法分離羥臍血單個(gè)核細(xì)胞的最佳條件 .中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（45）：8447～8450.

210008南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科