周玉利　周青雪

T-SPOT.TB陽(yáng)性標(biāo)本抗原ESAT-6和CFP-10相關(guān)性的探討

周玉利周青雪

目的 探討T-spot.TB陽(yáng)性標(biāo)本抗原ESAT-6和CFP-10的相關(guān)性。方法 統(tǒng)計(jì)2011年1月至2014年7月檢測(cè)的T-spot.TB陽(yáng)性的333例結(jié)果，分析其中抗原ESAT-6與CFP-10的結(jié)果并評(píng)價(jià)相關(guān)性。結(jié)果 抗原ESAT-6陽(yáng)性占98.49%，抗原CFP-10陽(yáng)性占77.48%，抗原ESAT-6陽(yáng)性且CFP-10陰性占22.52%，抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽(yáng)性占10.51%，抗原ESAT-6陽(yáng)性合并CFP-10陽(yáng)性占66.97%。結(jié)論 T-spot陽(yáng)性標(biāo)本中，抗原ESAT-6合并CFP-10陽(yáng)性的比例最高，抗原ESAT-6陽(yáng)性且CFP-10陰性的比例高于抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽(yáng)性的比例。

結(jié)核桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn) 抗原靶蛋白6 濾過(guò)蛋白10

早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確診斷是降低結(jié)核病發(fā)病率、減少傳播機(jī)會(huì)、控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在較多缺陷，不足以滿足臨床需求。結(jié)核桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-spot.TB）是一項(xiàng)有效的結(jié)核輔助診斷手段，其敏感性和特異度均＞95%［1］。在歐洲已經(jīng)獲得批準(zhǔn)作為結(jié)核感染和結(jié)核潛伏感染篩查的重要檢測(cè)手段［2］。其是應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測(cè)機(jī)體內(nèi)經(jīng)結(jié)核特異性的RDl區(qū)編碼A抗原早期分泌性抗原靶蛋白6（ESAT-6）和B抗原培養(yǎng)濾過(guò)蛋白10（CFP-10）肽段庫(kù)刺激后釋放γ干擾素的特異性T細(xì)胞數(shù)量。據(jù)此判斷是否有結(jié)核桿菌感染的可能，本資料針對(duì)疑似結(jié)核患者T-spot.TB檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果，進(jìn)行抗原ESAT-6和CFP-10陽(yáng)性情況的分析，探討其相關(guān)性。

1　臨床資料

1.1一般資料 2011年1月至2014年7月本院333例疑似結(jié)核患者，血清標(biāo)本檢測(cè)T-spot.TB陽(yáng)性結(jié)果中男179例，女154例；年齡7～76歲，平均年齡（42.6±12.3）歲。

1.2儀器與試劑 Baker生物安全柜，RIVCO C02孵育箱。T-spot.TB試劑盒，淋巴細(xì)胞分離液、AIMV、RPMll640、ELISPOT計(jì)數(shù)儀由上海長(zhǎng)征復(fù)星公司提供。

1.3方法 （1）T-spot.TB檢測(cè)：按T-spot.TB試劑盒操作規(guī)范進(jìn)行。采集外周全血，無(wú)須空腹，需用肝素/肝素鋰/肝素鈉抗凝，不得使用EDTA抗凝。采血量要求：＜2歲兒童2～3ml，其他患者4～6 ml，免疫力低下/受抑制患者6～8ml；樣本室溫（15～25℃）保存與運(yùn)輸，不得冷凍/冷藏；樣本采集后4h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，8h內(nèi)完成檢測(cè)；1周內(nèi)有輸血史或做過(guò)PET-CT的患者會(huì)影響血液中淋巴細(xì)胞的分離，建議2周后再進(jìn)行檢測(cè)；運(yùn)輸過(guò)程中防止顛簸，避免樣本溶血影響結(jié)果。（2）操作過(guò)程：外周抗凝全血梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），結(jié)核特異性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，使其分泌γ-干擾素，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌的γ-干擾素與模板預(yù)包被的抗γ-干擾素抗體結(jié)合并固定在細(xì)胞周圍，傳統(tǒng)的ELISA“雙抗夾心法”使抗原抗體結(jié)合物顯色，形成斑點(diǎn)，根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)判斷結(jié)果，抗原ESAT-6檢測(cè)孔為測(cè)試孔A，抗原CFP-10檢測(cè)孔為測(cè)試孔B。（3）用ELISPOT計(jì)數(shù)儀（AID iSPOT Reader spectrum，ZEISS，德國(guó)）進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀與統(tǒng)計(jì)：空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)＜10且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)＞20時(shí)視為實(shí)驗(yàn)有效。判定標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)測(cè)試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：空白對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)且（抗原A或抗原B孔斑點(diǎn)數(shù)）-（空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）≥6，判斷為陽(yáng)性（+）；空白對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)時(shí)且（抗原A或抗原B孔斑點(diǎn)數(shù)）≥2×（空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)），判斷為陽(yáng)性（+）；若上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔正常時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性（-）。若陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥10或陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＜20時(shí)，結(jié)果不能確定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1333例T-SPOT.TB陽(yáng)性患者抗原ESAT-6與抗原CFP-10統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1　333例T-SPOT.TB陽(yáng)性患者抗原ESAT-6與抗原CFP-10統(tǒng)計(jì)結(jié)果［n（%）］

2.2333例T-SPOT.TB陽(yáng)性患者各科室分布情況 在本院內(nèi)分泌科、感染科、消化科、呼吸科、兒科的T-spot. TB陽(yáng)性患者中，抗原ESAT-6陽(yáng)性CFP-10陽(yáng)性組，抗原ESAT-6陽(yáng)性且CFP-10陰性組，抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽(yáng)性組，分別所占各科室總數(shù)的比例相近，與全院所占的比例66.97%、22.52%、10.51%相符。

3　討論

T-spot.TB技術(shù)是利用結(jié)核桿菌感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞中存在結(jié)核特異性T細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌IFN-γ 而設(shè)計(jì)的T細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)。根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)可以推測(cè)體內(nèi)是否存在對(duì)結(jié)核桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。T-spot.TB檢測(cè)采用的MTB特異性抗原為ESAT-6和CFP-10（遺傳基因RD1區(qū)丟失），其蛋白編碼來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌基因中的一個(gè)菌種特異性基因片斷，被稱為RD1，這個(gè)基因片段在大部分的分枝桿菌以及所有的環(huán)境分枝桿菌（包括卡介苗）中不存在，因此ESAT-6和CFP-10作為抗原有較高的特異性［3］。但M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登） 四種分枝桿菌亦存在此兩種抗原，T-spot.TB陽(yáng)性結(jié)果有可能是上述分枝桿菌感染引起的。

ESAT-6和CFP-10蛋白是牛分枝桿菌的免疫優(yōu)勢(shì)抗原，可誘導(dǎo)宿主特異性CD4+T細(xì)胞、CD8+、CTL增殖及IFN-7大量產(chǎn)生，在保護(hù)性細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，且能介導(dǎo)長(zhǎng)期持久的免疫記憶。但是現(xiàn)今T-spot.TB技術(shù)處于發(fā)展階段還存在較多不足，該試劑盒在診斷活動(dòng)性結(jié)核病方面的作用尚待確定，目前只能用于檢測(cè)是否有結(jié)核感染，并不能鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染［4，5］。

總之，測(cè)孔 A和檢測(cè)孔B由于所使用的抗原不同，所引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)不完全一致，ESAT-6抗原的靈敏度高于CFP-10抗原。且ESAT-6對(duì)潛伏感染檢測(cè)較為有效，但單獨(dú)使用檢出率較低。兩者具有互補(bǔ)性，兩者聯(lián)合檢測(cè)顯著提高檢測(cè)的靈敏度。ESAT-6抗原和CFP-10檢測(cè)相關(guān)性意義值得更深入研究。

1 Meier T， Eulenbruch HP， Wrighton-Smith P， et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay （T SPOT-TB） for diagnosis of tuberculosis in clinical.practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2005，24（8）：529～536.

2 Alfred A Lardizabal.Interferon-Gamma release assay for detection of tuberculosis infection.US Respiratory Disease，2006，54（6）： 59～61.

3 Kim SH ，Song KH，Choi SJ，et al.Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. Am J Med，2009，122（2）：189.

4 Sztajnbok F R，Boecha N L，Sztajnbek D C，et al.The challenge of pediatric tuberculosis in face of new diagnostic techniques .J Pediatr（Rio J），2009， 85（3）： 189～193.

5 Ariga H，Harada N.Evolution of IGRA researches . Kekkaku，2008，83（9）：641～652.

310006 杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科