王巧玲　徐　辰　王　越　劉厚奇★

雷帕霉素對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老抑制的作用研究

王巧玲徐辰王越劉厚奇★

目的 通過探討雷帕霉素對(duì)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）衰老的影響，推動(dòng)其臨床應(yīng)用。方法 將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCS）分為對(duì)照組及雷帕霉素組。β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)檢測UC-MSC細(xì)胞內(nèi)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SABG）的表達(dá)量；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（CCK8）檢測UC-MSC細(xì)胞的增殖；Real-time PCR檢測UC-MSC細(xì)胞中衰老、增殖與干性相關(guān) mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與無水乙醇對(duì)照組相比，雷帕霉素組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽性率及染色深度均降低；細(xì)胞增殖加快；增殖、干性基因升高同時(shí)伴有衰老相關(guān)基因的下降。結(jié)論 雷帕霉素能夠減緩人臍帶MSCs的衰老。

雷帕霉素 間充質(zhì)干細(xì)胞 增殖 衰老

雷帕霉素的作用機(jī)制是PI（3）K家族相關(guān)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶mTOR的活性，主要通過抑制mTOR復(fù)合體1（mTORC1），參與調(diào)控細(xì)胞生長以及代謝［1］。研究表明雷帕霉素能增加生命年限［2～4］。雷帕霉素可抑制BMSC體外培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象。本文自2013年12月至2014年6月實(shí)驗(yàn)資料旨在探究雷帕霉素對(duì)人臍帶MSCs的作用，推動(dòng)干細(xì)胞臨床研究的發(fā)展。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑 人臍帶MSCs（UC-MSCs）為本教研室?guī)齑?。胎牛血清FBS、DMEM、0.25trypsin、青鏈霉素購自Gibco公司；雷帕霉素購自GeneOperation公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）及細(xì)胞衰老β- 半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天公司；核酸提取試劑盒RNAiso Plus及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoTaq Green Master Mix購自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Master Mix （2×） kit購自Roch公司。引物由杰李公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 UC-MSCs復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液中，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后按下列分組進(jìn)行處理。（1）對(duì)照組：給予含1/1000無水乙醇的正常培養(yǎng)基。（2）雷帕霉素組：濃度為1pmol/ml、2pmol/ml、5pmol/ml的A、B、C三組，其中β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)只采用對(duì)照組與C組。

1.3β-半乳糖苷酶染色檢測UC-MSC細(xì)胞衰老 將UC-MSC細(xì)胞接種于48孔板，只用對(duì)照組及C組，相應(yīng)處理24h后，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定15min，按說明書配置新鮮染色工作液150μl/孔，37℃孵育過夜。移除染色工作液，加入PBS后普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.4Cell Counting Kit-8 檢測UC-MSC細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期UC-MSC細(xì)胞以每孔約2000個(gè)細(xì)胞接種于96孔中，分對(duì)照組、A、B、C四組，每組6個(gè)孔，無水乙醇及雷帕霉素處理48h后，每天檢測每組的一個(gè)孔，連續(xù)6d。檢測當(dāng)天，更換培養(yǎng)液100μl，加入10μl CCK-8溶液，孵育2h后用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度。最終繪制一條增殖曲線。

1.5總RNA抽提和real-time PCR 將處于對(duì)數(shù)生長期的UC-MSC細(xì)胞接種于12孔板，采用無水乙醇及雷帕霉素處理48h后，去除培養(yǎng)液，用RNAiso Plus試劑盒按說明書抽提總RNA。酶標(biāo)儀檢測計(jì)算RNA濃度和純度后，按相應(yīng)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后，Real-time PCR檢測相應(yīng)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件：95℃ 5min；95℃20s，60℃ 15s，72℃ 20s，共40個(gè)循環(huán)。采用Applied Biosystems 公司StepOneTMSoftware（V2.1）計(jì)算各樣本中目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)≥3次，每組2復(fù)孔。PCR引物序列見表1。

表1　實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

2　結(jié)果

2.1雷帕霉素能夠降低UC-MSCs的衰老 β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)顯示：本實(shí)驗(yàn)采用 C濃度處理組以及無水乙醇對(duì)照組兩組細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下可見雷帕霉素組UC-MSC細(xì)胞呈現(xiàn)較低的β-半乳糖苷酶染色陽性率及染色深度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2雷帕霉素能夠增加UC-MSCs的增殖 本實(shí)驗(yàn)分A、B、C三個(gè)處理組及對(duì)照組，連續(xù)6d同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行CCK-8的檢測。在干預(yù)3d后，各組增殖曲線開始出現(xiàn)改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01） 。

2.3雷帕霉素增加細(xì)胞周期及干性正相關(guān)mRNA的表達(dá)，而降低衰老相關(guān)mRNA表達(dá)量 Real-time PCR主要檢測了細(xì)胞周期、衰老相關(guān)基因cycline2、cycd1、cdk4、P16、P21、OCT4、NANOG等基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示處理組及對(duì)照組各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01） 。

3　討論

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類殘留于成體組織內(nèi)的干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化能力及較高的增殖能力［5］。然MSCs體外擴(kuò)增培養(yǎng)一段時(shí)間后，逐漸失去其自我更新以及分化能力［6］。Gharibi B在骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）中發(fā)現(xiàn)阻滯PI3K/Akt/mTOR可以阻礙BMSC細(xì)胞老化相關(guān)表型的出現(xiàn)以及維持培養(yǎng)早期的形態(tài)，保持較高的克隆形成能力及增加增殖特性［7］。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討雷帕霉素對(duì)UC-MSCs衰老的作用，細(xì)胞的衰老是指細(xì)胞周期穩(wěn)定阻滯同時(shí)伴有一定的表型改變，如功能的喪失、DNA損傷和損傷相關(guān)半乳糖甘酶（SABG）的升高等，其中SABG常用來確定體內(nèi)組織的衰老［1］。β-半乳糖苷酶染色檢測UCMSCs中SABG，確定雷帕霉素對(duì)UC-MSCs的衰老抑制作用表型；P16由INK4/ARF基因座編碼，INK4/ ARF去抑制能顯著引發(fā)衰老［8，9］。本資料結(jié)果表明雷帕霉素可以降低P16，而顯著減弱UC-MSC細(xì)胞的體外培養(yǎng)衰老。CCND、CCNE及CDK4的表達(dá)可以推動(dòng)G1期快速通過R限制點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)變［10］。本資料中雷帕霉素呈濃度依賴性提高CCND1、CCNE2及CDK4的表達(dá)，提示其通過上調(diào)上述基因的表達(dá)而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞衰老的發(fā)生的作用。最近研究表明，加入雷帕霉素或抑制mTORC1能夠保存、甚至減緩體內(nèi)組織中殘留干細(xì)胞的功能［1］。mTOR 及其下游基因能長期維持人胚胎干細(xì)胞的自我更新［11］。雷帕霉素處理老年鼠能增加腸干細(xì)胞的功能［12］，保存造血干細(xì)胞（HSC）的自我更新及造血功能。雷帕霉素抑制mTOR活性后能夠阻止干細(xì)胞衰老，增加口腔角蛋白細(xì)胞等表皮干細(xì)胞的自我更新及克隆形成能力，繼而增強(qiáng)對(duì)放射治療引起的黏膜炎的能力［8］，并可以調(diào)控干細(xì)胞的分化與維持其多能性。在諸多多能性因子中，OCT4、NANOG、SOX2是維持胚胎干細(xì)胞（ES）多潛能性和自我更新的關(guān)鍵基因，特別是OCT4的表達(dá)量可以精確的調(diào)控ES的多能性，目前大部分的體細(xì)胞重編程過程，大多均利用外源性過表達(dá)OCT4等多能性因子，促使體細(xì)胞成為多能干細(xì)胞或胚胎樣干細(xì)胞，獲得體外無限增殖及多向分化功能。BMSC中過表達(dá)OCT4、NANOG之后增加MSC細(xì)胞的增殖、分化潛能、抑制其內(nèi)源性的分化［6］。人MSC中敲低P21后增殖加快，干性標(biāo)志物亦相應(yīng)增加［6］。本實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素可以通過抑制UC-MSC細(xì)胞中OCT4、NANOG、P21多蛋白mRNA水平，獲得較快的增殖與多能性。

UC-MSC細(xì)胞取材方便無痛，低免疫原性，高增殖，在臨床應(yīng)用方面更具優(yōu)勢，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，UCMSCs能夠改善自身免疫性腦脊髓炎小鼠的行為功能和組織病理損傷，可以顯著減緩中腦動(dòng)脈阻塞（MCAO）損傷模型鼠的局部損傷［13］，在體外的培養(yǎng)液伴有增殖的減慢、干性的丟失等一些列衰老表現(xiàn)，對(duì)于其機(jī)制研究及相應(yīng)的減緩措施少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從上述三個(gè)方面探討了雷帕霉素對(duì)UC-MSCs體外培養(yǎng)的衰老抑制作用及其可能作用機(jī)制，為UC-MSCs衰老的研究提供一個(gè)參考，為UC-MSCs體外培養(yǎng)及應(yīng)用提供一個(gè)新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

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Objective To investigate the effect of Rapamycin in the senescence process of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（UC-MSCs）. Methods UC-MSCs were divided into Rapamycin group and absolute alcohol control group.The measure of senescence-associated b-galactosidase （SABG） of UC-MSCs were detected by Beta galactosidase staining reagent.The proliferation performance of UC-MSC were examined by Cell Counting Kit-8（CCK8）.The expressions of senescence，proliferation and stemness relative mRNA were examined by real-time PCR. Results Compared with the absolute alcohol control group，The Rapamycin group show a lower positive rate and dyeing depth of Beta galactosidase staining. Rapamycin treated UC-MSCs present a higher rate of proliferation.The expressions of proliferation，stemness related mRNA were elevated，with an decrease of senescence relative mRNA. Conclusion Rapamycin slows down the senescence phenotype.

Rapamycin Mesenchymal stem cells Proliferation Senescence

200433 第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室