丁一心　張光波　趙光耀　陳衛(wèi)昌★

·論著·

CD235a+CD71+細(xì)胞在胃癌患者體內(nèi)表達(dá)的臨床意義

丁一心張光波趙光耀陳衛(wèi)昌★

目的 初步探討胃癌患者外周血中CD235a+CD71+細(xì)胞的表達(dá)水平及臨床意義。方法 流式細(xì)胞儀檢測(cè)64例胃癌患者及30例健康人外周血中CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)水平，初步分析其與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；qRT-PCR分析胃癌組和健康對(duì)照組該群細(xì)胞的基因表達(dá)差異，初步探究其免疫抑制作用的分子機(jī)制。結(jié)果 胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)顯著高于健康人［（30.34±18.29）% vs（22.36±7.86）%，P＜0.01］，且表達(dá)率與胃癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度密切相關(guān)；胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞的Arg1和TNF-α基因表達(dá)較健康人明顯下調(diào)（Foldchange＞2.0）。結(jié)論 與健康對(duì)照組相比，胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)水平顯著升高，且與胃癌進(jìn)展相關(guān)，其涉及的分子機(jī)制可能與Arg1和TNF-α表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

胃癌 免疫抑制 CD235a+CD71+細(xì)胞

2013年Elahi S等［1］在新生兒臍帶血中發(fā)現(xiàn)了一群以CD235a+CD71+為特征的新型免疫抑制性細(xì)胞群體異常增高，在新生兒感染性疾病中抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)，是導(dǎo)致新生兒免疫低下的關(guān)鍵因素。然而該群細(xì)胞在腫瘤患者外周血中的表達(dá)特征、臨床意義和生物學(xué)功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)目利用流式方法檢測(cè)胃癌患者外周血中CD235a+CD71+細(xì)胞的表達(dá)，并結(jié)合臨床資料初步分析該細(xì)胞亞群與胃癌臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)程度的相關(guān)性，初步探討該群細(xì)胞在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義及可能的分子機(jī)制。

1　臨床資料

1.1一般資料 觀(guān)察組64例胃腺癌外周血標(biāo)本均取自本院2014 年1至6月間初診手術(shù)治療患者，均未接受放化療。男44例，女20例；年齡39～82歲，平均57.67歲。以上病例均經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)。對(duì)照組為健康體檢者30例，男20例，女10例；年齡40～80歲，平均56.33歲。

1.2儀器與試劑 FC-500型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）；FTC2000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Funglyn Biotech公司）；熒光標(biāo)記PE anti-human CD71、PE/Cy7 anti-human CD235a（均為Biolegend 公司）。

1.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)水平 外周血標(biāo)本采集均在患者住院后次日清晨，肝素抗凝真空采血管采集胃癌患者靜脈血2ml。標(biāo)本在24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血中單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），分為空白對(duì)照組、CD235a-PE/Cy7組、CD235a-PE/Cy7+CD71-PE組。4℃避光孵育30min，洗滌離心重懸后上流式機(jī)檢測(cè)CD235a+CD71+雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平，每例樣本均分析3×104個(gè)細(xì)胞左右。

1.4流式細(xì)胞術(shù)分選純化CD235a+CD71+細(xì)胞 將分別采集的健康體檢者及術(shù)前胃癌患者的靜脈血，肝素抗凝真空采血管分裝。利用上述Ficoll分離液分離出PBMC，濾膜過(guò)濾后定容，加入CD235a-PE/Cy7和CD71-PE。4℃避光孵育30min，洗滌離心重懸后上流式細(xì)胞分選儀純化出CD235a+CD71+細(xì)胞。

1.5qRT-PCR檢測(cè) 取純化CD235a+CD71+細(xì)胞的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR，鑒定胃癌患者和健康人員該群細(xì)胞相關(guān)功能因子Arg1、Arg2、IL-10、iNOS、TNF-α、TGF-β、IL-12、IL-6、PGE-2及IL-1β的表達(dá)水平。qRT-PCR檢測(cè)CD235a+CD71+細(xì)胞功能基因，DNA表達(dá)相對(duì)量=2-△ct，△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。Foldchange（差異倍數(shù)）=2-△△Ct［△△Ct =（胃癌患者目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）-（健康人目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）］。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取均值，倍數(shù)變化（FoldChange）＞2.0為差異具有顯著性。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá) 健康對(duì)照組和胃癌組患者外周血中CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)情況見(jiàn)圖1A。健康對(duì)照組CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)平均為（22.36±7.86）；胃癌組表達(dá)平均為（30.34±18.29），兩者存在顯著差異（P＜0.01）（圖1B）。

圖1　CD235a+CD71+細(xì)胞在胃癌患者外周血中表達(dá)

2.2胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)的臨床意義 見(jiàn)表1。

表1　胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)率與臨床病理因素分析（±s）

表1　胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)率與臨床病理因素分析（±s）

參數(shù)患者人數(shù)（n）CD235a+CD71+表達(dá)率（%）P值性別 男4431.18±19.620.553女2028.49±15.26年齡（歲） 30～603531.24±14.760.683≥602929.27±22.04分化程度 低/無(wú)4832.57±18.120.123中/高1624.50±17.11浸潤(rùn)深度 黏膜、肌層1720.24±12.33＜0.01漿膜、全層4734.29±18.48淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú)3723.14±15.20＜0.01有2735.97±18.28遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 無(wú)1527.73±18.86＜0.05有4939.77±11.53臨床分期 早期1917.80±9.05＜0.01中晚期4535.94±18.30

2.3胃癌組與健康組外周血CD235a+CD71+細(xì)胞功能基因差異分析 利用qRT-PCR方法初步分析胃癌組與健康組外周血CD235a+CD71+細(xì)胞中關(guān)鍵功能因子Ct值，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明胃癌組Arg1和TNF-α基因表達(dá)量較健康組明顯升高（Foldchange＞2.0），見(jiàn)表2。

表2　胃癌組與健康組外周血CD235a+CD71+細(xì)胞功能因子Arg1、TNF-α Ct值（x±s）

3　討論

免疫抑制性細(xì)胞群體在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用［2～5］。CD235a+CD71+細(xì)胞作為一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制性細(xì)胞亞群，在腫瘤外周血中的表達(dá)特征和臨床意義尚未見(jiàn)報(bào)道［6，7］。本項(xiàng)目初步檢測(cè)了胃癌患者外周血中該細(xì)胞的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床資料初步分析其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。

通過(guò)檢測(cè)胃癌患者外周血CD235a+CD71+細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，與早期胃癌組相比，中晚期胃癌組CD235a+CD71+細(xì)胞水平顯著升高；而且在不同腫瘤浸潤(rùn)程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者之間，該亞群的表達(dá)也存在明顯差異。因此，檢測(cè)CD235a+CD71+細(xì)胞水平可能有助于評(píng)估胃癌進(jìn)展的程度。

Elahi S等［1］通過(guò)體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD235a+CD71+細(xì)胞阻礙CD8+T細(xì)胞活化，抑制TNF-α表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制功能；利用特異性阻滯劑阻斷精氨酸酶（Arg）通路，發(fā)現(xiàn)該群細(xì)胞對(duì)成年脾臟免疫細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)。這表明CD235a+CD71+細(xì)胞可能通過(guò)精氨酸酶通路來(lái)抑制免疫細(xì)胞活化，維持機(jī)體免疫抑制狀態(tài)。為初步探討CD235a+CD71+細(xì)胞在胃癌進(jìn)展中可能的分子機(jī)制，選擇Arg、TNF-α、iNOS等功能因子做相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者來(lái)源的CD235a+CD71+細(xì)胞Arg1和TNF-α的mRNA表達(dá)均顯著低于健康對(duì)照組。Arg1是一類(lèi)三聚體雙核含錳金屬酶，該分子表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致精氨酸蓄積，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)、微血管形成和向周?chē)M織轉(zhuǎn)移［8，9］；在缺乏精氨酸的內(nèi)環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞增殖受到了顯著抑制［10，11］。因此推測(cè)CD235a+CD71+細(xì)胞 Arg1表達(dá)下調(diào)，可以通過(guò)精氨酸蓄積促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)［12，13］。TNF-α是CD235a+CD71+細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵分子［1］，本資料發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中該細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低。TNF-α表達(dá)上調(diào)并與其受體結(jié)合可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖分化，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)；TNF-α也可提高腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，抗腫瘤新生血管形成。所以TNF-α表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)了胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。這可能是CD235a+CD71+細(xì)胞在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮作用的機(jī)制，其確切的分子機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

綜上所述，本項(xiàng)目初步發(fā)現(xiàn)CD235a+CD71+細(xì)胞表達(dá)水平與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)程度相關(guān)。但該群細(xì)胞確切的臨床意義和生物學(xué)機(jī)制尚需擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)一步探索。

1 Elahi S， Ertelt JM， Kinder JM ，et al. Immunosuppressive CD71+ erythroid cells compromise neonatal host defence against infection. Nature，2013，504（7478）：159～162.

2 Kollmann TR ，Levy O ，Montgomery RR， et al. Innate immune function by Toll-like receptors： distinct responses in newborns and the elderly.Immunity，2012，37（5）：771～783.

3 PrabhuDas M， Adkins B， Gans H， et al. Challenges in infant immunity：implications for responses to infection and vaccines. Nature Immunol，2011， 12（3）：189～194.

4 Zaghouani H， Hoeman CM ， Adkins B. Neonatal immunity： faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol，2009，30（12）：585～591.

5 Kollmann TR， Crabtree J， Rein-Weston A， et al. Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults. Immunol，2009，183（11）：7150～7160.

6 Wheatley DN， Campbell E. Arginine deprivation， growth inhibition and tumour cell death：Deficient utilisation of citrulline by malignant cells.Br J Cancer， 2003， 89（3）：573～576.

7 Derek K，Geraldine S， Yu H. An Effective Marker for erythroid Precursors in Bone Marrow Biopsy Specimens.Hematopathology，2010，134（3）： 429～435.

8 Bronte V， Zanovello P. Regulation of immune responses by L-arginine metabolism. Nature Rev. Immunol，2005，5（8）： 641～654.

9 Cheng PN，Lam TL，Lam WM，et al.Pegylated recombinant human arginase inhibits in vitro and in vivo proliferation of human hepatocellular carcinoma through arginine depletion.Cancer Res，2007， 67（1）： 309～317.

10 Liu Q， Zhang C， Sun A， et al. Tumor-educated CD11b regulatory dendritic cells suppress T cell response through arginase-I.Immunol，2009，182（10）：6207～6216.

11 Sun MH， Han XC， Jia MK， et al.Expressions of inducible nitric oxide synthase and matrix metalloproteinase-9 and their effects on angiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma. World J Gas troenterol，2005，11（38）：5931～5937.

12 ChungDJ，RossiM，Romano E，et al.Indoleamine 2， 32dioxygenase2 expressing mature human monocyte2derived dendritic cells expand potent autologous regulatory T cells. Blood，2009，114（3）：555～563.

13 Feun L， You M， Wu CJ， et al. Arginine deprivation as a targeted therapy for cancer.Curr Pharm Des，2008，14（11）：1049～1057.

Objective To explore the expression level and clinical signifi cance of CD235a+CD71+cells among the peripheral blood in gastric cancer patients. Methods A total of 64 gastric cancer patients and 30 controls patients were prospectively enrolled in this study. The expression level of CD235a+CD71+cells from peripheral blood was measured by fl ow cytometry in gastric cancer patients and healthy controls，and then the relationship between the two cell subsets and clinical pathology of gastric cancer was further explored. The differences of gene expression of the cell subsets from gastric cancer patients and healthy controls were evaluated by qRT-PCR to explore molecular mechanism of this cell subset's immunosuppression. Results The expression level of CD235a+CD71+cells from the peripheral blood in gastric cancer was signifi cantly higher than which in healthy controls［（30.34± 18.29）% vs.（22.36±7.86）%，P＜0.01］，and was positively correlated with clinical staging，lymphatic metastasis rate，distant metastasis rate and invasion depth of gastric cancers. The gene expression levels of Arg1 and TNF-α in CD235a+CD71+cell from the peripheral blood of gastric cancer patients were signifi cantly lower than that of healthy controls（Foldchange＞2.0）.Conclusion CD235a+CD71+cell among the peripheral blood in gastric cancer is associated with clinical pathology of cancer，which is able to act as an effective indicator to evaluate the state of gastric cancer patients.

Gastric cancer Immunosuppression CD235a+CD71+cell

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81272737）

215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院