徐青山 李曉香 張 嬌 秦玉明 駱其君

（1.程海保爾生物開發(fā)有限公司，云南 麗江674202；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波315211）

蝦青素是近年來走入國際研發(fā)領(lǐng)域的類胡蘿卜素。它廣泛存在于自然界中，也是海洋動物體內(nèi)最主要的類胡蘿卜素之一。研究表明，蝦青素具有強大的清除氧自由基的能力，其抗氧化性是類胡蘿卜素的10倍，是維生素E的550倍，被譽為“超級抗氧”[1-2]。鑒于蝦青素的抗氧化功能，且對人體的絕對安全性，在國外已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，食品，保健及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[3-4]。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）在特定的條件下可積累本身干重的1%以上的蝦青素，是天然蝦青素“濃縮品”和最好的生物來源[5-6]。

雨生紅球藻是一種淡水單細胞微藻，屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬。其具有特殊的生物學(xué)性質(zhì)，即在弱光及營養(yǎng)豐富的條件下，以游動的綠色營養(yǎng)細胞存在，而在不利于其生長的條件下，以不動厚壁孢子存在，同時在體內(nèi)積累大量的蝦青素[7-8]。鑒于雨生紅球藻此生長特點，目前國際上成功的生產(chǎn)模式都采用了兩階段生產(chǎn)方式，即先采用封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)實現(xiàn)細胞的高密度營養(yǎng)生長、克服污染問題，再采用流行的開放池系統(tǒng)在脅迫條件下使細胞積累蝦青素[9]。本項目旨在利用雨生紅球藻的培養(yǎng)及蝦青素的提取實驗中獲得的方法，結(jié)合現(xiàn)實生產(chǎn)條件，將技術(shù)應(yīng)用到生產(chǎn)實際中，進一步的推廣雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)和蝦青素的提取技術(shù)。

1 雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)

目前雨生紅球藻的培養(yǎng)主要分為兩個階段：細胞生長繁殖階段和蝦青素的積累階段。

1.1 細胞生長繁殖階段

雨生紅球藻的生長繁殖階段采用逐級擴大培養(yǎng)的方式。各級培養(yǎng)所需淡水取自程海湖，營養(yǎng)液配制與補充均采用MAV母液。

1.1.1 一級培養(yǎng)

利用5000ml三角瓶室內(nèi)密封恒溫培養(yǎng)。三角燒瓶使用之前用草酸清洗并用清水沖洗三遍，每瓶加入培養(yǎng)所用淡水，加熱煮沸消毒后用牛皮紙和橡皮筋密封并冷卻至室溫。加入適量營養(yǎng)鹽母液后，藻液按1：3的比例接入，接種細胞密度為1000～6000個/毫升，密封培養(yǎng)。光照強度控制在4000～5000lx，每天搖瓶3～4次以保證充足的二氧化碳溶解量，室內(nèi)溫度控制在25～27℃。每天取樣計數(shù)，監(jiān)測藻細胞的濃度。待細胞處于指數(shù)生長期時，取一部分藻液繼續(xù)用于一級培養(yǎng)，以保證藻種的規(guī)模；一部分用于二級培養(yǎng)，以逐級擴大生產(chǎn)規(guī)模。

1.1.2 二級培養(yǎng)

利用50L白色塑料桶密封充氣培養(yǎng)。充氣系統(tǒng)包括鼓風(fēng)機，主充氣管，支充氣管和氣石，支充氣管和氣石需加熱煮沸消毒后才可使用。白桶使用之前用消毒水清洗并用清水沖洗干凈，加入淡水45L后再加入消毒片消毒。消毒6h后加入適量硫代硫酸鈉中和漂白精，待完全中和后加入營養(yǎng)鹽母液并接入一級培養(yǎng)至指數(shù)生長期的藻種，接種比例根據(jù)藻液的濃度確定，并將已加熱消毒后的支充氣管和氣石安裝好進行充氣，用尼龍塑料和橡皮筋密封。培養(yǎng)過程中光照控制在4000—5000lx。每天計數(shù)監(jiān)測藻細胞密度，待藻細胞進入到指數(shù)生長期時，培養(yǎng)至細胞密度為10萬～25萬個/毫升，擴大至三級培養(yǎng)。

1.1.3 三級培養(yǎng)

利用100～200 m2水泥池攪拌培養(yǎng)。消毒池和攪拌車用消毒水清洗干凈后，加入培養(yǎng)所需淡水，高度控制在30～40cm。按照比例均勻加入漂白粉原池消毒過夜。消毒6h后加入適量硫代硫酸鈉中和漂白粉，待完全中和后加入營養(yǎng)鹽母液并接入藻種，攪拌培養(yǎng)，光照控制在5000～6000 lx。每天計數(shù)監(jiān)測藻細胞密度，培養(yǎng)至雨生紅球藻細胞密度達到6萬～12萬個/毫升，到達適宜密度時用于下一步生產(chǎn)流程。

關(guān)于雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，已取得了一項專利：大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素的裝置和簡易方法（專利號：ZL200610154678），并有一項專利已受理：一種培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法（申請?zhí)枺?00910099708.6）。

1.2 蝦青素的積累階段

蝦青素的積累階段需要建特殊的收集池。收集池面積大至和三級培養(yǎng)池相同，約100～200m2，池底要鋪表面光滑的瓷磚，并要有一定的坡度，以便沖洗收集。

待三級培養(yǎng)的雨生紅球藻到達一定的濃度，將上層活力較好的藻細胞液轉(zhuǎn)移到收集池。三級培養(yǎng)池底層的藻液含有較多的死細胞和雜質(zhì)，將其丟棄。轉(zhuǎn)移至收集池的雨生紅球藻，光照強度控制在10000lx以上，利用攪拌車進行攪拌并加入一定濃度的氯化鈉，進行其蝦青素的積累過程。待到藻細胞完全變?yōu)殒咦?，上層水體已基本無顏色，便可進行下一步生產(chǎn)程序。

2 雨生紅球藻的收集

經(jīng)過蝦青素的積累階段之后，藻細胞已完全轉(zhuǎn)化為紅色孢子，沉入池底，上層藻液已無藻細胞，水色變清。此時將上層清水排至污水處理廠，之后通過較大的水容器連接收集池的排水口和高速連續(xù)離心機，進行雨生紅塵球藻的收集。收集過程中，用水泵將收集池底的雨生紅球藻沖至排水口的水容器，同時利用高速連續(xù)離心機對沖出的含雨生紅球藻的水體進行離心，完成雨生紅球藻的收集過程。

3 蝦青素的提取

經(jīng)過離心收集后的雨生紅球藻藻粉，首先進行噴霧干燥，之后利用超聲波技術(shù)對雨生紅球藻進行破壁處理，之后利用蝦青素的脂溶性特性，對處理后的藻液進行油溶萃取，萃取后的脂溶液進行離心處理，收集上清液，得到蝦青素，蝦青素累積可達1.0%以上。在雨生紅球藻的收集，蝦青素的提取技術(shù)方面從擴紅球藻的食品加工方面，已取得一項專利：一種紅球藻、菊署的食品及其制備方案（專利號：ZL200910099707.7）。

雨生紅球藻中蝦青素的含量很高，是天然蝦青素的最好生物來源，如何大規(guī)模的培養(yǎng)雨生紅球藻以及從中高效率的提取蝦青素已成為生產(chǎn)天然蝦青素的重要途徑。相比于國外先進的生產(chǎn)技術(shù)，我國雨生紅球藻的培養(yǎng)及蝦青素提取技術(shù)尚處于實驗起步階段，本文創(chuàng)新了雨生紅球藻的培養(yǎng)及蝦青素的提取實驗中獲得的方法，為國內(nèi)首次報道，再結(jié)合生產(chǎn)實際條件，運用適宜的生產(chǎn)設(shè)備，將該技術(shù)措施應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中，將進一步的推廣雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)和蝦青素的提取技術(shù)，獲得了適應(yīng)范圍廣，生長速度快，蝦青素累積可達1.6%以上的技術(shù)指標，將產(chǎn)生良好的示范效應(yīng)，推動我國微藻養(yǎng)殖與加工及市場開發(fā)相銜接的新型產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展。

［1］李曉夢,齊安翔,蔡明剛,等.雨生紅球藻室外大體積培養(yǎng)與蝦青素積累初步研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報,2006,5：245-249.

［2］莊惠如,陳必鏈,王明茲,等.雨生紅球藻混合營養(yǎng)與異養(yǎng)研究[R].微生物學(xué)通報,2000,27：198-201.

［3］蔡明剛,王杉霖,李文權(quán),等.天然蝦青素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進展[R].臺灣海峽,2003,22：377-385.

［4］CrungM D,S ouzaF ML,B orowitzkaM,et a l.Algalca rotenoidsH.S econdaryc arotenoids2.H aematococcuspl uvialisa planosproesasa so astaxanthine sters[J].JA pplph ycol,19,92(4)：165-171.

［5］莊惠如,盧海聲,陳必鏈,等.雨生紅球藻營養(yǎng)細胞的蝦青索累積[J].水生生物學(xué)報,2001,25(4)：376-378.

［6］魏東,減曉南.大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素的研究進展和產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀[J].中國海洋藥物,2001(5)：4-8.

［7］殷明焱.雨生紅球藻細胞周期及調(diào)控研究[J].中科院海洋研究所,1998.

［8］CrungM D,S,Borowitzka,etal.Algalca rotenoids.Secondaryc arotenoids.H aematococcuspl uvialisa planosproesasa so astaxanthine sters[J].JA pplph ycol,1992(4)：165-171.

［9］FischerP,Kl einU.L ocalizationo fn itrogen～assimilatingenz ym es in t he c hloroplasto fC hlamydomonasr einhardtii[J].Pla nt P h ysiol,1988,88(1)：947-952