張惠峰，綦天華

（長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，吉林 長春 130033）

高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留量的不確定度評定

張惠峰1，綦天華2

（長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，吉林 長春 130033）

依據(jù)JJF1059—2012 《測量不確定度評定與表示》和CNAS-GL-06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》，建立了高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留的不確定度評定的數(shù)學(xué)模型。對測量過程中各不確定度來源進(jìn)行分析，計算各不確定度分量，最后給出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴展不確定度，評定結(jié)果表明：不確定度主要來源于測試過程的隨機效應(yīng)、曲線校準(zhǔn)和樣品處理過程。

不確定度；甲基睪酮；高效液相色譜法；水產(chǎn)品

甲基睪酮又名甲睪酮、甲基睪丸酮、甲基睪丸素。是一種合成類固醇，屬于蛋白同化激素，具有雄性和蛋白同化雙重作用［1-2］。曾作為一種性激素和強壯劑被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，如羅非魚、鯉魚、鰻魚、鱔魚、鱒魚、甲魚等。甲基睪酮代謝時間長，對人類的危害是慢性、遠(yuǎn)期和積累性的，主要干擾體內(nèi)自然激素的平衡，使生理功能紊亂，并且可干擾肝內(nèi)毛細(xì)膽管的排泄功能［3］。目前，高效液相色譜法已廣泛用于水產(chǎn)品中甲基睪酮的定量檢測，我國已規(guī)定在水產(chǎn)品中甲基睪酮為不得檢出，因此對甲基睪酮殘留量的監(jiān)測已成為一項重要的常規(guī)檢測項目［4］。

測量不確定度對于測量結(jié)果之間的比較、數(shù)據(jù)解釋、檢測程序中需要注意的因素、方法的確認(rèn)等都有著十分重要的意義，因此在水產(chǎn)品安全檢測等各領(lǐng)域越來越受到重視。學(xué)者曾研究了水產(chǎn)品中孔雀石綠［5-6］、多氯聯(lián)苯［7］、硝基呋喃類代謝物［8］、揮發(fā)性鹽基氮［9］、磺胺類藥物［10］、喹諾酮類藥物［11］等殘留量檢測方法［12-17］的不確定度評定，目前國內(nèi)尚無甲基睪酮殘留量測定不確定度評定的相關(guān)報道。本實驗依據(jù)不確定度的評定的基本方法和程序［18-22］，以高效液相色譜法［23］為例，探討水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留測定的不確定度的來源、分析評定、合成及結(jié)果表述。建立該方法的測量不確定度模型，分析影響測定結(jié)果的各主要分量，在實際操作中可用于指導(dǎo)分析人員進(jìn)行重點控制，從而提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

水產(chǎn)品（鱈魚、鯉魚、鳙魚） 長春東北亞物流有限公司；甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀（配紫外檢測器和自動進(jìn)樣器） 美國Agilent公司；XS205分析天平 瑞士Mettler公司；TE212-L電子天平 德國Sartorius公司；TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；Research plus可調(diào)量程移液器 德國Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用甲醇溶解，定容于500 mL容量瓶中，質(zhì)量濃度為20 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 mL用甲醇稀釋并定容至10 mL容量瓶，質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、10.00、5.001.00、 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，供高效液相色譜分析。

1.3.2樣品提取和凈化

樣品處理采用SC/T 3029—2006《水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留量的測定：液相色譜法》［23］進(jìn)行，方法檢出限10 μg/kg。，具體步驟如下：精確稱取5.00 g經(jīng)充分勻漿的魚肉于50 mL玻璃離心管中，加入20 mL乙醚，旋渦混勻15 min，4 000 r/min離心10 min，所得上清液移至雞心瓶；殘渣加入15 mL乙醚再提取一次，合并上清液至雞心瓶，在40 ℃左右水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘渣中加入5 mL甲醇溶液（4∶1）清洗，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞玻璃離心管中。加入4 mL石油醚至離心管中，加塞旋渦混勻2 min，4 000 r/min離心10 min，棄去上層石油醚層；下層加入4 mL石油醚重復(fù)操作一次。下層甲醇溶液在40 ℃左右水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞離心管。加入2 mL水清洗瓶壁，合并水溶液，加入4 mL乙醚，旋渦混勻2 min，4 000 r/min離心10 min，取上層乙醚層于雞心瓶中；下層用4 mL乙醚再提取一次，合并上層至雞心瓶中。在40 ℃左右水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，1 mL流動相定容，經(jīng)聚四氟乙烯膜過濾，待測。

1.3.3色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（72∶28 ，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1建立數(shù)學(xué)模型

式中：w為水產(chǎn)樣品中藥物殘留量/（μg/kg）；Cx為提取樣液中藥物質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Vx為提取樣液定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；為回收率校正因子。

2.2不確定度的來源分析

2.2.1曲線校準(zhǔn)過程引入的不確定度

包括標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合所引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程所引入的不確定度。其中標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度、移液管和容量瓶體積的不確定度、校準(zhǔn)和使用溫度不同導(dǎo)致的不確定度組成。

2.2.2樣品質(zhì)量引入的不確定度

由天平的最大允許誤差構(gòu)成。

2.2.3樣品加標(biāo)過程引入的不確定度

由目標(biāo)樣品在制備過程中由于加標(biāo)的體積的不確定度構(gòu)成，非加標(biāo)樣品可不考慮該部分。

2.2.4樣品前處理過程引入的不確定度

測試樣品的制備過程非常復(fù)雜，每一步操作均會引入不確定度，采用檢測方法確認(rèn)中的回收率對制樣過程中引入的不確定度進(jìn)行評定。

2.2.5體積引入的不確定度

由定容體積和進(jìn)樣體積的不確定度構(gòu)成。

2.2.6儀器引入的不確定度

由液相色譜儀引入的不確定度。

2.2.7測試過程隨機效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度

包括樣品的均勻性和代表性、天平的重復(fù)性、體積刻度充滿的重復(fù)性、進(jìn)樣的重復(fù)性、和儀器積分面積重復(fù)性等因素引起的不確定度。

2.3不確定度的分量評定

根據(jù)不確定度的來源分別對校準(zhǔn)過程、樣品質(zhì)量、樣品加標(biāo)、樣品處理、液相色譜測試及隨機過程中引入的不確定度進(jìn)行單個分量的量化評定。

2.3.1曲線校準(zhǔn)過程引入的不確定度

2.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)給uprel出的擴展不確定度，屬于正態(tài)分布，置信概率p=95%，包含因子k=2，為B類評定，up=0.5/2=0.25uprel=up/ p=0.25/99.0=0.002 5根據(jù)上述計算公式可求得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對不確定度為0.002 5。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入不確定度umxrel標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量質(zhì)量為0.010 0 g，使用XS205電子天平稱量，該天平經(jīng)計量檢定為Ⅰ天平，檢定分度值為0.1 mg，依據(jù)JJG 1036—2008 《電子天平檢定規(guī)程》［24］稱量范圍0≤m≤5 g時最大允許誤差為±0.05 mg（0.5e），按照均勻分布計算，為B類評定。則其不確定度為相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：umxrel=umx/mx=0.002 9。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液定容引入的不確定度uVsrel：按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［25］，20 ℃時，500 mL容量瓶（A級）最大允許誤差為±0.25，滿足均勻分布，k=，為B類評定。由量器校準(zhǔn)引入的不確定度為：uml=0.25/=0.144 mL，相對不確定度為umlrel=uml/m=0.144/500=0.000 3容量瓶在20 ℃條件下檢定校準(zhǔn)，因溶劑體積受溫度變化的影響遠(yuǎn)大于各量器自身，因此僅考慮前者。標(biāo)準(zhǔn)儲備液在（20±2）℃條件下配制，溶劑為甲醇，20 ℃時甲醇體積膨脹系數(shù)為α=0.2×10-3℃-1。按照均勻分布，則因溫度變化引起溶劑體積改變的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uV=ΔV/，ΔV=V×ΔT×α，溫度對體積影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.2/=0.692，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uTrel=0.692/500=0.001 4。標(biāo)儲溶液定容過程相對不確定度合成為

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度uVWrel，由量器校準(zhǔn)和環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變引入不確定度組成：（1）量器校準(zhǔn)引入的相對不確定度uVWlrel

標(biāo)液稀釋過程中所使用量器見表1，參考JJG196—2006［25］和JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》［26］要求，依據(jù)相應(yīng)最大允許誤差，計算得每次定容量器校準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表1，具體步驟同umlrel，則合成相對不確定度為：

表1　量器校準(zhǔn)引入的不確定度Table 1 Uncertainties caused by container calibration

（2）環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uV2rel

標(biāo)液稀釋過程中所用溶劑為甲醇，實驗溫度為（2 0±2）℃，計算過程同uTrel，各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2，則合成相對不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中由原始標(biāo)物、標(biāo)物稱量、標(biāo)儲定容、標(biāo)液稀釋引入的相對不確定度合成為：

表2　環(huán)境溫度變化引入的不確定度Table 2 Uncertainties caused by environmental temperature changes

2.3.1.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度u（xpred）rel

配制甲基睪酮的7 個不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/mL），對標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測溶液分別用液相色譜測試1 次，得到相應(yīng)的峰面積A，采用最小二乘法擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程Y=aX+b（b為截距，a為斜率）和方程的線性相關(guān)系數(shù)如表3所示。

表3　甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果Table 3 Standard curves of methyltestosterone

依據(jù)校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，結(jié)合由用來導(dǎo)出校準(zhǔn)曲線的軟件提供的出殘余標(biāo)準(zhǔn)誤差s，由y的（隨機）變化性，預(yù)估計值xpred的不確定度可計算得，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對不確定度為0.000 02，為A類評定。

式中：s為由軟件給出的殘余標(biāo)準(zhǔn)誤差；xpred為被測溶液的估計值，用被測溶液的平均值表示；為繪制工作曲線的全部x值的平均值；p為對被測溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行的測定次數(shù)；n為對標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行測定的次數(shù)。

2.3.1.3曲線校準(zhǔn)過程引入的不確定度u（cal）rel

曲線校準(zhǔn)過程中由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對不確定度合成為：

2.3.2樣品質(zhì)量引入的不確定度umrel

樣品的稱量質(zhì)量為5.00 g，使用賽多利斯TE212-L電子天平稱量，該天平經(jīng)計量檢定為Ⅲ級天平，依據(jù)檢定證書和JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》［24］，該天平檢定分度值為0.1 g，稱量范圍0.2 g≤m≤5 g時最大允許誤差為按照均勻分布計算，為B相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3樣品加標(biāo)過程引入的不確定度ualrel

目標(biāo)樣品用10～1 000 μL移液器向鱈魚空白基質(zhì)樣品中加入1 000 μL質(zhì)量濃度為4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液制備而成，實驗溫度為（20±2）℃，計算過程同uVsrel，為B類評定。由此產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ual=5.773 7 μL，相對不確定度為ualrel=5.773 7/1 000=0.005 8。

樣品前處理過程中產(chǎn)生的不確定度屬于A類評定，采用回收率6 個平行樣品（鱈魚、鯉魚、鳙魚樣品各2份）添加回收率的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行計算。回收率分別為 79.3%、77.6%、79.7%、75.7%、76.3%、75.5%。根據(jù)回收率平均值（ec）的標(biāo)準(zhǔn)差的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：

平行樣品提取樣液中藥物質(zhì)量濃度分別為3.39、3.18 μg/mL，提取樣液定容體積1.00 mL，樣品質(zhì)量5.00 g，檢測結(jié)果分別為678、636 μg/kg，平均值回收率校正因子校正，樣品中甲基睪酮殘留量檢測結(jié)果分別為877、823 μg/kg，平均值

2.3.5由定容體積引起的不確定度uVrel

樣品使用1 mL移液器加入1.0 mL流動相定容。流動相的主要組成為甲醇，實驗在（20±2）℃條件下進(jìn)行，為B類評定，計算過程同uVsrel，樣品定容引人的相對不確定度為uVrel=0.006 0。

2.3.6由液相色譜儀引入的不確定度uuvwrel

根據(jù)儀器檢定證書，整機定量重復(fù)性RSD6=0.12%，為B類評定。

測試過程隨機效應(yīng)通過樣品的重復(fù)測定進(jìn)行不確定度評定，屬于A類評定。測定樣品中甲基睪酮殘留量，檢測結(jié)果分別為678、636 μg/kg，平均值按照矩形分布處理，則測試過程隨機效應(yīng)導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.4合成不確定度及擴展

合成不確定度采用方和根法，即將各個標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量平方后求其和再開根。因不確定度分量較多且其大小也比較接近時，估計為正態(tài)分布，選95%的包含概率時，包含因子取k=2，對不確定度進(jìn)行擴展。

2.4.1合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

將測試過程中由曲線校準(zhǔn)、稱量質(zhì)量、樣品加標(biāo)、定容體積、樣品前處理過程、液相色譜儀、隨機效應(yīng)引入的相對不確定度合成為：w=（850±79）μg/kg；k=2。

2.4.2合成相對擴展不確定度Urel

在95%置信水平下，k=2時，試樣甲基睪酮含量測定的相對擴展不確定度為：Urel=k×urel由實驗數(shù)據(jù)的平均值計算試樣中甲基睪酮含量w=（850±79）μg/kg，故其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U=k×u=0.093 0×850=79.0 μg/kg。

2.5測量結(jié)果報告

目標(biāo)樣品甲基睪酮含量測試結(jié)果表示為w=（850±79）μg/kg；k=2。無論是給出擴展不確定度還是標(biāo)準(zhǔn)不確定度，通常不確定度的有效數(shù)字不多于兩位。測試結(jié)果應(yīng)根據(jù)所給出的不確定度進(jìn)行修約。

2.6各影響因素的不確定結(jié)果

各影響因素的不確定結(jié)果見表4。

表4　各影響因素的不確定度結(jié)果Table 4 Uncertainty evaluation for the determination

3　結(jié) 論

對實驗結(jié)果進(jìn)行不確定度評定時要考慮試驗過程的每個環(huán)節(jié)，但不是所有不確定度的來源都有評估其不確定度所需的數(shù)據(jù)，且這些來源也不一定是獨立的，如抽樣方法、樣品的均一性、樣品的儲存條件、樣品的影響、空白修正、方法的偏差等，可依據(jù)實際情況篩選進(jìn)行取舍。當(dāng)被測量值在法規(guī)給出規(guī)定限值時，應(yīng)當(dāng)關(guān)注限值中是否給出不確定度的允許量，并在評價符合性時依據(jù)不同情況考慮分析結(jié)果的不確定度。根據(jù)t檢驗判斷平均回收率與1.0有顯著性差異，檢測結(jié)果必須經(jīng)過校正。通過對試驗過程中各相對不確定度分量分析可知，試驗過程中不確定度的主要來源為測試過程的隨機效應(yīng)，其次為標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)過程，以及樣品的處理過程。因此建議在實際操作過程中增加平行樣的測定次數(shù)，不斷熟悉樣品處理過程以提高回收率，并且應(yīng)盡量減少標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋倍數(shù)。此外，實驗室建立良好的實驗環(huán)境條件、使用高精密度和穩(wěn)定性的儀器設(shè)備并定期進(jìn)行檢定/校準(zhǔn)，使用高純度的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、開展新檢測項目時進(jìn)行方法確認(rèn)并選用性能參數(shù)較好的檢測方法等都將有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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［18］ 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. JJF 1059—2012 測量不確定度評定與表示［S］. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2012.

［19］ 中國合格評定國家認(rèn)可委員會. CNAS-GL05 測量不確定度要求的實施指南［S］. 北京： 中國計量出版社社， 2011.

［20］ 中國合格評定國家認(rèn)可委員會. CNAS-GL06 化學(xué)分析中不確定度的評估指南［S］. 北京： 中國計量出版社社， 2006.

［21］ 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. JJF 1135—2005 化學(xué)分析測量不確定度評定［S］. 北京： 中國計量出版社， 2005.

［22］ 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計量司. 測量不確定度評定與表示指南［S］. 北京： 中國計量出版社， 2000.

［23］ 農(nóng)業(yè)部. SC/T 3029—2006 水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留量的測定： 液相色譜法［S］. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

［24］ 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. JJG 1036—2008 電子天平檢定規(guī)程［S］.北京： 中國計量出版社， 2008.

［25］ 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. JJG 196—2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］. 北京： 中國計量出版社， 2006.

［26］ 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. JJG 646—2006 移液器檢定規(guī)程［S］.北京： 中國計量出版社， 2006.

Uncertainty Evaluation for Determination of Methyltestosterone Residue in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Huifeng1， QI Tianhua2
（Changchun Inspection Center for Aquatic Products Safety and Quality， Changchun 130033， China）

According to the basic methods for uncertainty evaluation from Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement （JJF1059-2012） and Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis （CNAS-GL-06） a mathematical model of uncertainty evaluation for the determination of methyltestosterone residue in aquatic products by HPLC was established. The sources of determination uncertainty were analyzed and each component of uncertainty was quantified. The combined standard uncertainty and expanded uncertainty were finally obtained. The major uncertainty sources were the random effects in testing process， curve calibration and sample pretreatment.

uncertainty； methyltestosterone ； high performance liquid chromatography （HPLC）； aquatic products

TS207.3

A

1002-6630（2015）18-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201518037

2014-12-19

長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估專項（2014-1485）

張惠峰（1982—），女，副研究員，碩士，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全及水環(huán)境研究。 E-mail：xiaoqiutong@126.com