莫開菊，趙 娜，朱照武，田盼盼，程 超

（1.湖北民族學院生物科學與技術(shù)學院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

葛仙米多糖的單糖組成分析

莫開菊1，2，趙 娜1，朱照武1，田盼盼1，程 超1

（1.湖北民族學院生物科學與技術(shù)學院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法及HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用法測定葛仙米多糖的單糖組成，兩種方法測定結(jié)果相互吻合。同時采用HPLC法測定了相關(guān)單糖的標準曲線，相關(guān)系數(shù)達到0.995以上，經(jīng)計算，葛仙米多糖的單糖組成物質(zhì)的量比甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖為1∶1.12∶3.24∶1.72∶1.21。

葛仙米多糖；單糖；柱前衍生；高效液相色譜；質(zhì)譜

葛仙米（Nostoc sphaeroides Kützing）是藍藻門念珠藻科的一種低等的單細胞藍藻，古名天仙菜、天仙米，俗稱水木耳［1］，在世界上的分布稀少，我國的葛仙米主要分布在湖北省鶴峰縣的走馬坪［2］。有研究［3-4］表明，葛仙米不僅是含有多種人體必需氨基酸的高蛋白食品，還含有豐富的多糖類物質(zhì)?？茖W研究已經(jīng)證實，多糖類物質(zhì)具有許多生物活性，包括抗腫瘤、激活免疫力、降血糖、抗病毒［5］，近年來，我國對植物多糖尤其是具有中國特色的中草藥多糖的藥物活性展開了廣泛研究［6］，葛仙米中含量豐富的多糖具有極大的研究價值。多糖的活性與許多因素有關(guān)，特別是其空間結(jié)構(gòu)，多糖的一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，而多糖的單糖組成又是一級結(jié)構(gòu)的主要內(nèi)容［7-8］，因此，多糖的單糖組成是研究多糖的生物活性的基礎(chǔ)。

由Honda等［9-11］發(fā)展和完善的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定單糖含量的方法目前已被廣泛應(yīng)用于各種多糖的單糖組分研究［12-14］，采用HPLC-質(zhì)譜（mass spectrum，MS）聯(lián)用法研究單糖組成還較少，但在其他方面的應(yīng)用比較成熟，如游離氨基酸［15］、食品添加劑［16］、未知成分的鑒定［17-18］等。本研究選用PMP柱前衍生HPLC法研究葛仙米多糖的單糖組成，并采用HPLC-MS進行驗證，以確定葛仙米多糖的單糖組分，為葛仙米多糖結(jié)構(gòu)的研究提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葛仙米 湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)。

D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖 德國Dr.Ehrenstorfer公司；D-葡萄糖、L-巖藻糖 美國Sigma公司；PMP、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司；三氟乙酸（色譜純）成都西亞化工股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

P680 ALPG型HPLC儀（包括DAD-100檢測器、TCC-100柱溫箱和Chromeleon色譜工作站） 戴安中國有限公司；1290-G6224A型HPLC-MS聯(lián)用儀（包括G4212-60008型紫外檢測器） 美國安捷倫公司；MS1 Minishaker漩渦混合器 德國IKA公司；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司；NBS-Ⅱ型氮吹儀 艾本森科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1多糖的提取、分離與純化

稱取一定量的葛仙米清洗、脫色、粉碎、脫脂后，按料水比1∶90于90 ℃水浴鍋中提取6 h，旋蒸濃縮，60%乙醇溶液沉淀，冷凍真空干燥。稱取凍干葛仙米多糖，蒸餾水溶解，采用Sevag法脫蛋白，在用60%乙醇溶液沉淀，并再次冷凍干燥得到葛仙米多糖樣品，備用。

1.3.2標準單糖的衍生化及標準曲線的繪制

分別配制濃度均為5 mmol/L的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及巖藻糖標準溶液；配制濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L的單糖混合標準液。分別取50 μL的單糖標準液及不同濃度梯度的混合標準溶液，各加50 μL 0.6 mol/L的NaOH溶液，置于5 mL的具塞試管中，漩渦混勻；再加100 μL 0.5 mol/L的PMP（0.435 5 g/5 mL）甲醇溶液，漩渦混勻，在70 ℃的烘箱中避光反應(yīng)100 min，取出避光放置10 min冷卻至室溫，加100 μL 0.3 mol/L的HCl溶液中和，加水至2 mL，再加等體積的氯仿，漩渦混勻，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3 次。將水相用0.45 μm微孔膜過濾后供HPLC進行分析，作為定性定量的依據(jù)。

1.3.3樣品的水解及衍生化

吸取100 μL質(zhì)量分數(shù)為5 mg/mL的多糖樣品溶液于5 mL的安瓿瓶中，加入100 μL濃度為4 mol/L的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，充N2封管，在110 ℃的烘箱中水解4 h；冷卻后將水解液轉(zhuǎn)移至5 mL的離心管中，并用100 μL甲醇沖洗轉(zhuǎn)移殘余水解液，加200 μL甲醇后用N2吹干，如此重復加甲醇并用N2吹干3 次，去除TFA；加入50 μL超純水溶解殘渣，得水解樣品。按1.3.2節(jié)方法衍生、中和、萃取，0.45 μm微孔膜過濾后，超聲脫氣，進行HPLC檢測分析。衍生、中和、萃取后的樣品稀釋25 倍后過0.45 μm微孔膜過濾、超聲脫氣，再進行HPLC-MS分析。

1.3.4HPLC分析條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A液：0.1 mol/L的pH 6.7磷酸鉀鹽緩沖液，B液：乙腈，梯度洗脫0～25 min，A-B體積比83.2∶16.8，25～36 min，A-B體積比80∶20；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：20 μL。

1.3.5HPLC-MS分析條件

HPLC條件：DIKMA Endeavorsil C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：0.01 mol/L乙酸銨-乙腈溶液體積比82∶18；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；流速：0.2 mL/min；進樣體積：2.5 μL。

MS條件：電噴霧離子源正離子模式（+），載氣為氮氣，流速10 L/min，溫度350 ℃，霧化器壓力30 psi，毛細管電壓4 000 V，質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～1 700。

2　結(jié)果與分析

2.1葛仙米多糖的HPLC分析

2.1.1單糖PMP衍生物的HPLC分離及標準曲線

圖1　8 種單糖的HPLC分離效果Fig.1 The separation of monosaccharide derivatives by HPLC

表1　標準曲線的線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations with correlation coeffi cients

8種單糖的PMP衍生物在HPLC中得到較好的分離，如圖1所示，混合標準液中各單糖PMP衍生物的流出順序及保留時間依次為甘露糖13.900 min、鼠李糖19.208 min、葡萄糖醛酸20.542 min、半乳糖醛酸23.633 min、葡萄糖28.775 min、半乳糖30.433 min、阿拉伯糖31.667 min和巖藻糖33.860 min。8 種單糖的濃度與峰面積的回歸方程如表1所示，其相關(guān)系數(shù)為0.995 4～0.999 3。

2.1.2葛仙米多糖單糖組成的HPLC分析

5 mg/mL葛仙米多糖溶液水解、衍生后，在檢測條件下進行HPLC分離定性。如圖2所示，葛仙米多糖中單糖的保留時間與標準樣品甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的保留時間十分吻合，初步說明葛仙米多糖由這5 種單糖組成。根據(jù)單糖的峰面積及標準曲線，計算得物質(zhì)的量比為1∶1.12∶3.24∶1.72∶1.21。

圖2　葛仙米多糖水解樣品衍生物的HPLC分離效果Fig.2 The separation of polysaccharide hydrolysate derivatives by HPLC

2.1.3方法的精密度

取混合單糖標準品的PMP衍生物，重復進樣5 次，測試儀器的精密度，結(jié)果見表2，5 種單糖的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于5%，說明儀器穩(wěn)定性較良好。

取5 份葛仙米多糖溶液，分別水解、衍生后，在測定條件下進行HPLC分析，除葡萄糖醛酸衍生物外，組成葛仙米多糖的其余4 種單糖衍生物的峰面積RSD均小于5%，說明樣品的處理測試方法可靠，見表2。

表2　方法精密度實驗結(jié)果Table 2 Precision （relative standard deviation） of the HPLC method

2.2葛仙米多糖單糖組成的HPLC-MS分析

2.2.1單糖PMP衍生物的HPLC-MS分析

8 種單糖標準溶液和混合標準液進行PMP衍生后，利用HPLC-MS分析，結(jié)果表明8 種單糖衍生物能較好分離，混標的紫外吸收圖譜及總離子流圖如圖3所示。

圖3　8 種單糖衍生物的HPLC-MS分離效果圖Fig.3 The separation of monosaccharide derivatives by HPLC-MS

如圖3所示，混標中8 種單糖的PMP衍生物在HPLCMS中能很好的分離，流出順序及保留時間依次為甘露糖7.073 min、鼠李糖9.607 min、葡萄糖醛酸11.900 min、半乳糖醛酸13.227 min、葡萄糖15.687 min、半乳糖17.933 min、阿拉伯糖19.707 min和巖藻糖23.000 min。

2.2.2葛仙米多糖單糖組成的HPLC-MS驗證

葛仙米多糖水解衍生后，經(jīng)HPLC-MS在檢測條件下分析，樣品的紫外及總離子流圖如圖4所示，葛仙米多糖中單糖的組成為甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，其質(zhì)荷比及出峰時間與標準單糖十分吻合，如表3所示。

表3　葛仙米多糖水解液衍生物的HPLC-MS分析結(jié)果Table 3 The HPLC-MS results of polysaccharide hydrolysate derivatives

圖4　葛仙米多糖水解液衍生物的HPLC-MS分離效果圖Fig.4 The separation of polysaccharide hydrolysate derivatives by HPLC-MS

綜合分析HPLC-MS的離子流圖和紫外吸收圖譜表明葛仙米多糖由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，與HPLC分析結(jié)果一致，驗證了HPLC分析的準確性。

3　討 論

本實驗采用HPLC和HPLC-MS檢測了葛仙米多糖的單糖組成，兩種方法的結(jié)果互相驗證，結(jié)果表明，葛仙米多糖由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成。同時還采HPLC法測定了相關(guān)單糖的標準曲線，經(jīng)計算5 種單糖的物質(zhì)的量比為1∶1.12∶3.24∶1.72∶1.21。

圖2中HPLC的檢測結(jié)果對照標準品圖譜，在鼠李糖和半乳糖醛酸保留時間處有疑似色譜峰，經(jīng)HPLC-MS驗證，提取m/z 495的離子流圖，在9.471 min處有明顯離子流信號，但未發(fā)現(xiàn)紫外吸收。MS的檢測靈敏度高于HPLC，對比鼠李糖標準品的紫外圖譜及離子流圖，峰高分別為1×101和2.9×105，而樣品對應(yīng)的離子流圖中疑似鼠李糖處的峰高為7.2×103，若樣品中含鼠李糖，按比例估算在紫外圖譜中的峰高約0.25，較不明顯，因此，樣品可能含鼠李糖，其存在需進一步驗證；提取m/z 525的離子流圖，在13.227 min左右無離子流信號，樣品中未檢測到半乳糖醛酸。

圖2樣品HPLC的檢測結(jié)果顯示，在19.208、23.633 min疑似檢出鼠李糖和半乳糖醛酸，在HPLCMS圖譜中，其相應(yīng)的保留時間分別在9.607 min和13.227 min。提取樣品圖譜相應(yīng)時間點上的紫外和離子流圖，在9.471 min發(fā)現(xiàn)m/z 495的明顯離子流信號，但無紫外吸收，這可能是鼠李糖的含量低于紫外檢測限，也可能是相同分子質(zhì)量的其他無紫外吸收的物質(zhì)；因此不能排除含有鼠李糖的可能性。但是HPLC法對鼠李糖的檢出限為0.17 nmol，本實驗所有濃度遠高出檢出限，卻只出現(xiàn)了難以分辨的小峰，即使存在，其濃度也非常低。因此本研究不作報道。但是13.227 min的紫外檢測圖和m/z 525的離子流圖，均未發(fā)現(xiàn)明顯吸收峰。因此半乳糖醛酸未檢出。

在實驗中發(fā)現(xiàn)，同一樣品放置過夜后再進行HPLC分析，峰面積減小。說明PMP單糖衍生物隨時間推移可能降解，張萍等［19-20］曾提出過PMP衍生物穩(wěn)定性不夠的問題，徐瑾［21］對單糖PMP衍生物的穩(wěn)定性進行了研究，發(fā)現(xiàn)24 h后，衍生物的峰面積均發(fā)生明顯降低，而馬定遠等［22］的研究表明10.5 h后，甘露糖和鼠李糖衍生物的峰面積已經(jīng)降低。因此樣品衍生后應(yīng)盡快測定，避免長時間存放。關(guān)于單糖PMP衍生物的降解規(guī)律將另文發(fā)表。

此外，圖2中10.2 min處有明顯出峰，但標準品圖1譜中并沒有，對比空白實驗，此處為PMP峰，在萃取時未徹底除去，因此，有必要提高三氯甲烷萃取PMP的程度，而Castells等［23］曾指出在PMP萃取過程中伴隨著單糖衍生物的損失。因此，使用PMP作為衍生劑時，需要平衡好PMP去除與樣品損失的關(guān)系。

［1］ 譚學儒. 葛仙米簡介［J］. 中國食物與營養(yǎng)， 1985（5）： 45.

［2］ 朱玉婷, 譚姚, 莫開菊. 硫酸酯化修飾葛仙米多糖工藝研究［J］. 食品科學， 2011， 32（24）： 46-49.

［3］ 劉金龍. 葛仙米營養(yǎng)成分研究［J］. 中草藥， 2000， 31（11）： 862.

［4］ 汪興平， 程超. 野生葛仙米營養(yǎng)成分分析及評價［J］. 食品科學， 2002，23（8）： 288-290.

［5］ 田志環(huán)， 焦傳珍. 葛仙米研究現(xiàn)狀及其開發(fā)前景［J］. 食品研究與開發(fā)， 2007， 28（2）： 170-172.

［6］ 柳志宇. 瑪咖多糖提取及其單糖組成的研究［D］. 北京： 北京林業(yè)大學， 2012.

［7］ 王蓉， 吳劍波. 多糖生物活性的研究進展［J］. 國外醫(yī)藥： 抗生素分冊，2001， 22（3）： 97.

［8］ 陳克克. 地瓜兒多糖的單糖組成實驗中兩種流動相的比較研究［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學， 2009， 55（5）： 41-45； 49.

［9］ HONDA S， AKAO E， SU-UZKI S， et al. High-perfor mance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly uitravioletabsorbing and electrochemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives［J］. Analytical Biochemistry， 1989， 180： 351-357.

［10］ HONDA S， TOGASHI K， TAGA A. Unusual separation of l-phenyl-3-mehtyl-5-pyrazolone derivatives of aldoses by capillary zone electrophoresis［J］. Journal of Chromatography A， 1997， 791： 307-311.

［11］ HONDA S， SUUZKI S， TAGA A. Analysis of carbohydrates as l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives by capillary/microchip electrophoresis and capillary electrochromatography［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2003， 30： 1689-1714.

［12］ 戴軍， 朱松， 湯堅， 等. PMP柱前衍生高效液相色譜法分析杜氏鹽藻多糖的單糖組成［J］. 分析測試學報， 2007， 26（2）： 206-210.

［13］ 郝蕾蕾， 張典瑞， 趙忠熙， 等. 柱前衍生化HPLC法測定黃河灘棗多糖的單糖組成［J］. 中國生化藥物雜志， 2012， 33（6）： 740-743.

［14］ 范剛， 唐策， 李艷， 等. 柱前衍生HPLC分析黃連多糖的單糖組成［J］.中國實驗方劑學雜志， 2014（11）： 74-78.

［15］ 王一紅， 馮家力， 潘振球， 等. 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析18種游離氨基酸［J］. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2006， 16（2）： 161-163； 239.

［16］ 許秀敏， 吳西梅， 梁春穗， 等. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉［J］. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2005， 15（9）：1057-1059.

［17］ 趙超群， 李櫻紅， 羅金文. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定保健食品中添加的10 種化學藥物［J］. 藥物分析雜志， 2014（9）： 1627-1633.

［18］ STEPHAN B， MICHAEL O， CHRISTIAN D. Qualitative and quantitative analysis of carbonyl compounds in ambient air samples by use of an HPLC-MS method［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2002， 3： 372； 622-629.

［19］ 張萍， 王仲孚， 黃琳娟. 糖類物質(zhì)的衍生化試劑： 氘代PMP和類似物的合成及其衍生化性能［J］. 合成化學， 2013， 21（3）： 262-266； 293.

［20］ 張萍. 1，3取代吡唑啉酮類試劑的合成及其用于糖類物質(zhì)的衍生化和分析研究［D］. 西安： 西北大學， 2011.

［21］ 徐瑾. 糖類物質(zhì)的衍生化分離分析方法研究［D］. 南京： 南京理工大學， 2003.

［22］ 馬定遠， 陳君， 李萍， 等. 柱前衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成［J］. 分析化學， 2002， 30（6）： 702-705.

［23］ CASTELLS C B， ARIAS V C， CASTELLS R C. Precolumn derivatization of reducing carbohydrates with 4-（3-methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl）benzoic acid. Study of reaction， high-performance liquid chromatographic separation and quantitative performance of method［J］. Chromatographia， 2002， 56（3/4）： 153-160.

Analysis of Monosaccharide Composition of Polysaccharide from Nostoc sphaeroides Kützing

MO Kaiju1，2， ZHAO Na1， ZHU Zhaowu1， TIAN Panpan1， CHENG Chao1
（1. School of Biological Science and Technology， Hubei University for Nationalities， Enshi 445000， China；2. Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization， Enshi 445000， China）

Two analytical methods， namely high performance liquid chromatography （HPLC） and HPLC-mass spectrometry（HPLC-MS） using precolumn derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone were established for analyzing the monosaccharide composition of polysaccharide from Nostoc sphaeroides Kützing. Consistent results were obtained using both methods. The standard curve developed using monosaccharide standards by HPLC exhibited a correlation coeffi cient of greater than 0.995. According to the standard curves， the polysaccharide in N. sphaeroides was composed of manose，glucuronic acid， glucose， galactose and arabinose at a molar ratio of 1：1.12：3.24：1.72：1.21.

Nostoc sphaeroides Kützing polysaccharide； monosaccharide； precolumn derivatization； HPLC； MS

TS201.2

A

1002-6630（2015）18-0089-04

10.7506/spkx1002-6630-201518016

2015-01-30

國家自然科學基金面上項目（31171670）

莫開菊（1965—），女，教授，博士，研究方向為食品加工及天然產(chǎn)物化學。E-mail：hbmymkj@163.com